Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test

Pseudomonas aeruginosa insanlarda hayatı tehdit eden hastalıklara neden olabilir fırsatçı bir bakteriyel patojen, özellikle immunocompromised. P. aeruginosa patojenite proteazlar ve lipopolisakkarit de dahil olmak üzere birçok virülans faktörlerin ifade kaynaklanmaktadır, yanı sıra koruyucu bir biyofilm oluşturmak için yeteneği¹. Virülans faktörleri üretme ve insanlarda hastalığa neden olma becerisi nedeniyle, P. aeruginosa’yı ticari ürünler yapmak için kullanmak güvenlik kaygılarını da ortaya çıkarmaktadır. E. coli nonpatojenik suşları geleneksel olarak insan kullanımı için tıbbi ve ticari ürünlerin biyomühendisliğinde kullanılmaktadır. Ancak, bazı ürünler E. coli yapmak zordur, ve birçok ekleme organları paketlenmiş, çıkarma zahmetli hale. Salgıverim büyük olasılıkla verimi artırmak ve arıtma süreçlerini kolaylaştırmak gibi, belirli ürünler yapmak ve salgılamak yeteneği ile tasarlanmış bakteriyel suşları, son derece arzu edilir. Böylece, diğer bakteri türlerinin patojenik olmayan suşları (örneğin, daha fazla salgı yolları kullanan türler) E. coli’yeyararlı alternatifler sağlayabilir. Biz son zamanlarda P. aeruginosabir suşu gelişimi rapor , PGN5, hangi organizmanın patojenitesi ve toksisitesi yüksek zayıflatılmış². Daha da önemlisi, bu tür hala polisakkarit aljinat büyük miktarlarda üretir, P. aeruginosa biyofilm ticari olarak ilginç bir bileşeni.

PGN5 suşu, organizmanın patojenitesine katkıda bulunduğu bilinen beş geni(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA)sırayla silmek için pEX100T-NotI plazmid ile iki aşamalı bir allelik değişim prosedürü kullanılarak oluşturuldu. pEX100T-NotI Plazmid pEX100T, Herbert Schweizer’s lab^{geliştirilen}birden fazla klonlama sitesi içinde bir NotI restriksiyon enzim tanıma sitesi SmaI değiştirerek oluşturuldu^{3 ,4}. Restriksiyon enzimi NotI için tanıma sitesi SmaI ile karşılaştırıldığında daha nadir bir DNA dizisidir ve klonlanan dizilerde bulunma olasılığı daha düşüktür, bu nedenle klonlama amacıyla daha uygundur. Plazmid, ß-laktamaz kodlayan ve karbenisin direncini ortaya koyan bla geni ve sakaroza duyarlılık sağlayan B. subtilissacB geni de dahil olmak üzere seçime olanak sağlayan genleri taşır (Şekil 1A). Plazmid aynı zamanda E. coliile uyumlu çoğaltma(ori)ve konjugasyon yoluyla E. coli’den Pseudomonas türlerine plazmid transferine izin veren transferin(oriT)kökenini de taşır. Ancak, plazmid Pseudomonasile uyumlu çoğaltma bir kökeni yoksun , ve böylece Pseudomonas türleri içinde çoğaltmak olamaz (yani, bir Pseudomonas intihar vektörü). Bu özellikler pEX100T-NotI’yi Pseudomonas kromozomundaki genetik silmeleri hedeflemek için ideal kılmıştır. Plazmid klonlama adımları E. coli kullanılarak gerçekleştirilir ve ortaya çıkan plazmid dönüşüm veya konjugasyon ile Pseudomonas aktarılır. Daha sonra, homolog rekombinasyon olayları ve seçici adımlar sayesinde, hedeflenen çerçeve içi silme, işaretleyicisiz oluşturulur. P. aeruginosa kromozomundan genomik bölgeleri sırayla silebilmek için bu yöntem PGN5 gibi yüksek oranda zayıflatılmış Pseudomonas suşları oluşturmak veya diğer özel kullanımlar için suşları tasarlamak için kullanılabilir (örn. plazmid yayılımı için enforükleazlarda eksik suşlar veya ilgi proteinlerinin üretimi için protelazlarda eksik suşlar).

Bakteri suşlarının genel virülansı büyüme koşulları ve evrelerinden etkilenir ve bu süre zarfında mutasyonlar sık görülür. Bu nedenle, genetiği değiştirilmiş suşların güvenliğini ölçmek zor olabilir. Sistemik virülans için bakteriyel izole değerlendirmek için, C57BL/6 fareler⁵intraperitoneal enjeksiyon u tarafından daha önce yayınlanmış bir enfeksiyon protokolü uyarlanmış. Bu prosedürü, kullanılan suşların hassas dosupve kolay doğrulanmasına olanak sağlayan enjeksiyon için dondurulmuş bakteri stokları kullanmak üzere modifiye ettik. Bu modelde, Biyofarmasötik üretimi için FDA onaylı olan E. coli suşu BL21, suş göreceli patogenezi belirlemek için bir kontrol güvenlik standardı olarak kullanılmıştır^6,7,8. Bu yöntemi kullanmanın en büyük avantajı, enfeksiyon öncesi ve sonrası bakteri hücre numarası, fenotip ve genetik belirteçler için doğrulanmış olan bulaşma suşları, tekrarlanabilir olması ve varyasyon kaynaklarını en aza indirmesidir. Bu kontrollü adımlarla gerekli hayvan sayısı azalır. Bu modelde, enjekte edilen intraperitoneally e. coli BL21’e eşit veya daha az C57BL/6 murine mortalite oranlarına neden olan P. aeruginosa suşları zayıflatılmış kabul edilebilir. Bu basit fare enfeksiyonu modeli, referans olarak FDA onaylı E. coli suşunu kullanarak diğer türlerden genetik olarak tasarlanmış suşların zayıflatılmış patojenliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. 1-7. adımlar P. aeruginosa (Şekil 1)ve 8-12 adımlarında sıralı genomik silmelerin oluşumunu ayrıntılı olarak inceleyin.