Generación de mutantes de eliminación de genes en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas para la atenuación de la virulencia en un modelo simple de infección de ratón

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno bacteriano oportunista que puede causar enfermedades potencialmente mortales en humanos, especialmente en los inmunocomprometidos. La patogenicidad de P. aeruginosa se debe a la expresión de muchos factores de virulencia, incluyendo proteasas y lipopolisacáridos, así como su capacidad para formar una biopelícula protectora¹. Debido a su capacidad para producir factores de virulencia y causar enfermedades en los seres humanos, el uso de P. aeruginosa para hacer productos comerciales presenta problemas de seguridad. Cepas no patógenas de E. coli se han utilizado tradicionalmente para bioingeniero productos médicos y comerciales para uso humano. Sin embargo, algunos productos son difíciles de hacer para E. coli, y muchos se empaquetan en cuerpos de inclusión, lo que hace que la extracción sea laboriosa. Las cepas bacterianas diseñadas con la capacidad de fabricar y secretar productos específicos son altamente deseables, ya que la secreción probablemente aumentaría el rendimiento y facilitaría los procesos de purificación. Por lo tanto, cepas no patógenas de otras especies de bacterias (por ejemplo, especies que utilizan más vías de secreción) pueden proporcionar alternativas útiles a E. coli. Recientemente informamos del desarrollo de una cepa de P. aeruginosa,PGN5, en la que la patogenicidad y toxicidad del organismo está altamente atenuada². Es importante destacar que esta cepa todavía produce grandes cantidades de alginato polisacárido, un componente comercialmente interesante de la biopelícula de P. aeruginosa.

La cepa PGN5 se generó utilizando un procedimiento de intercambio alélico de dos pasos con el plásmido pEX100T-NotI para eliminar secuencialmente cinco genes (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) conocido por contribuir a la patogenicidad del organismo. pEX100T-NotI se generó cambiando el SmaI a un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción NotI dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido pEX100T, que fue desarrollado en el laboratorio de Herbert Schweizer^3,4. El sitio de reconocimiento de la enzima de restricción NotI es una secuencia de ADN más rara en comparación con SmaI y menos probable que esté presente en secuencias que se clonan, por lo que es más conveniente para fines de clonación. El plásmido lleva genes que permiten la selección, incluido el gen bla, que codifica la lactamasa y confiere resistencia a la carenicilina, y el gen B. subtilissacB, que confiere sensibilidad a la sacarosa (Figura 1A). El plásmido también tiene un origen de replicación (ori) compatible con E. coli,y un origen de transferencia (oriT) que permite la transferencia de plásmido de E. coli a las especies de Pseudomonas a través de la conjugación. Sin embargo, el plásmido carece de un origen de replicación compatible con Pseudomonas,y por lo tanto no puede replicarse dentro de las especies de Pseudomonas (es decir, es un vector suicida pseudomonas). Estas características hacen que pEX100T-NotI sea ideal para atacar deleciones genéticas del cromosoma Pseudomonas. Los pasos de clonación plásmidos se llevan a cabo utilizando E. coli y el plásmido resultante se transfiere a Pseudomonas por transformación o conjugación. A continuación, a través de eventos de recombinación homóloga y pasos selectivos, se genera la eliminación en trama objetivo, sin marcadores. Este método de eliminación secuencial de regiones genómicas del cromosoma de P. aeruginosa podría utilizarse para generar cepas de Pseudomonas altamente atenuadas, como PGN5, o para diseñar cepas para otros usos específicos (por ejemplo, cepas deficientes en endonucleases para la propagación de plásmidos o cepas deficientes en proteasas para la producción de proteínas de interés).

La virulencia general de las cepas de bacterias se ve afectada por las condiciones de crecimiento y las fases, durante las cuales las mutaciones ocurren con frecuencia. Por lo tanto, medir la seguridad de las cepas genéticamente diseñadas puede ser un desafío. Para evaluar los aislados bacterianos para la virulencia sistémica, adaptamos un protocolo de infección previamente publicado por inyección intraperitoneal de ratones C57BL/6⁵. Modificamos este procedimiento para utilizar existencias bacterianas congeladas para inyección, lo que permitió una dosificación precisa y una fácil validación de las cepas utilizadas. En este modelo, la cepa E. coli BL21, que ha sido aprobada por la FDA para la producción de biofarmacéuticos, se utilizó como un estándar de seguridad de control para determinar la patogénesis relativa de la cepa^6,7,8. La principal ventaja de utilizar este método es que es reproducible y minimiza las fuentes de variación, ya que las cepas infectantes se validan para el número de células bacterianas, fenotipo, y marcadores genéticos antes y después de la infección. Con estos pasos controlados, se reduce el número de animales requeridos. En este modelo, las cepas de P. aeruginosa que dan como resultado tasas de mortalidad murina C57BL/6 iguales o inferiores a E. coli BL21 cuando se inyectan por vía intraperitoneal pueden considerarse atenuadas. Este modelo simple de infección de ratón también se puede utilizar para evaluar la patogenicidad atenuada de cepas genéticamente diseñadas de otras especies utilizando la cepa E. coli aprobada por la FDA como referencia. Los pasos 1-7 detallan la generación de deleciones genómicas secuenciales en P. aeruginosa (Figura 1) y los pasos 8-12 detallan el uso de un modelo de ratón para probar la patogenicidad de las cepas de P. aeruginosa.