Generazione di mutanti di eliminazione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello di infezione del mouse

Pseudomonas aeruginosa è un patogeno batterico opportunistico che può causare malattie potenzialmente letali nell’uomo, specialmente nell’immunocompromesso. La patogenicità di P. aeruginosa è dovuta all’espressione di molti fattori di virulenza, tra cui proteasi e lipopolisaccharide, così come la sua capacità di formare un biofilm protettivo¹. A causa della sua capacità di produrre fattori di virulenza e causare malattie negli esseri umani, utilizzando P. aeruginosa per fare prodotti commerciali presenta problemi di sicurezza. I ceppi non patogeni di E. coli sono stati tradizionalmente utilizzati per bioingegnerizzare prodotti medici e commerciali per uso umano. Tuttavia, alcuni prodotti sono difficili da fare per E. coli, e molti sono confezionati in corpi di inclusione, rendendo l’estrazione laboriosa. Ceppi batterici ingegnerizzati con la capacità di fare e secernere prodotti specifici è altamente auspicabile, in quanto la secrezione probabilmente aumenterebbe i processi di purificazione della resa e della facilità. Pertanto, i ceppi non patogeni di altre specie di batteri (ad esempio, specie che utilizzano più percorsi di secrezione) possono fornire alternative utili a E. coli. Recentemente abbiamo riportato lo sviluppo di un ceppo di P. aeruginosa, PGN5, in cui la patogenicità e la tossicità dell’organismo è altamente attenuata². È importante sottolineare che questo ceppo produce ancora grandi quantità di polisaccharide alginata, una componente commercialmente interessante del biofilm P. aeruginosa.

Il ceppo PGN5 è stato generato utilizzando una procedura di scambio allelico in due fasi con il plasmid pEX100T-NotI per eliminare in sequenza cinque geni (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) noti per contribuire alla patogenicità dell’organismo. pEX100T-NotI è stato generato cambiando il SmaI in un sito di riconoscimento degli enzimi di restrizione NotI all’interno del sito di clonazione multipla del pEX100T pEX100T, sviluppato nel^laboratorio3^,4di Herbert Schweizer. Il sito di riconoscimento per l’enzima di restrizione NotI è una sequenza di DNA più rara rispetto a SmaI e meno probabilità di essere presente nelle sequenze clonate, quindi è più conveniente per scopi di clonazione. Il plasmide porta geni che consentono la selezione, compreso il gene bla, che codifica la lattamasi e conferisce resistenza alla carbenicillina, e il gene B. subtilissacB, che conferisce sensibilità al saccarosio (Figura 1A). Il plasmide porta anche un’origine di replica (ori) compatibile con E. coli, e un’origine di trasferimento (oriT) che permette il trasferimento di plasmide da E. coli alle specie di Pseudomonas attraverso la coniugazione. Tuttavia, il plasmide manca di un’origine di replica compatibile con Pseudomonas, e quindi non può replicare all’interno di specie Pseudomonas (cioè, è un vettore suicida Pseudomonas). Queste caratteristiche rendono pEX100T-NotI ideale per colpire le delezioni genetiche dal cromosoma Pseudomonas. Le fasi di clonazione plasmide vengono eseguite utilizzando E. coli e il plasmide risultante viene trasferito a Pseudomonas per trasformazione o coniugazione. Quindi, attraverso eventi di ricombinazione omologhi e passaggi selettivi, viene generata l’eliminazione in-frame mirata, senza marcatori. Questo metodo di eliminazione sequenziale delle regioni genomiche dal cromosoma di P. aeruginosa potrebbe essere utilizzato per generare ceppi Pseudomonas altamente attenuati, come PGN5, o per progettare ceppi per altri usi specifici (ad esempio, ceppi carenti in endonuclesi per la propagazione plasmida o ceppi carenti nelle proteasi per la produzione di proteine di interesse).

La virulenza complessiva dei ceppi di batteri è influenzata dalle condizioni di crescita e dalle fasi, durante le quali le mutazioni si verificano frequentemente. Pertanto, misurare la sicurezza dei ceppi geneticamente progettati può essere difficile. Per valutare gli isolati batterici per la virulenza sistemica, abbiamo adattato un protocollo di infezione pubblicato in precedenza mediante iniezione intraperitoneale di topi C57BL/6⁵. Abbiamo modificato questa procedura per utilizzare gli stock batterici congelati per l’iniezione, che ha permesso un dosing preciso e una facile convalida dei ceppi utilizzati. In questo modello, il ceppo E. coli BL21, approvato dalla FDA per la produzione di prodotti biofarmaceutici, è stato utilizzato come standard di sicurezza di controllo per determinare la patogenesi relativa del ceppo^6,7,8. Il vantaggio principale dell’utilizzo di questo metodo è che è riproducibile e riduce al minimo le fonti di variazione, in quanto i ceppi infettanti sono convalidati per il numero di cellule batteriche, il fenotipo e i marcatori genetici sia prima che dopo l’infezione. Con questi passaggi controllati, il numero di animali necessari è ridotto. In questo modello, i ceppi di P. aeruginosa che provocano C57BL/6 tassi di mortalità murina uguali o inferiori a E. coli BL21 quando iniettati intraperitonealmente possono essere considerati attenuati. Questo semplice modello murino di infezione può anche essere utilizzato per valutare la patogenicità attenuata dei ceppi geneticamente ingegnerizzati di altre specie utilizzando il ceppo E. coli approvato dalla FDA come riferimento. I passaggi da 1 a 7 descrivono in dettaglio la generazione di eliminazioni genomiche sequenziali in P. aeruginosa (Figura 1) e i passaggi 8-12 dettagliano l’uso di un modello murino per testare la patogenicità dei ceppi P. aeruginosa.