הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום
Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומשתנה של מודל העכבר של זיהום כדי להעריך את הנחת של זנים מהונדסים גנטית של הפסאודומונס aeruginosa בהשוואה לארצות הברית מינהל המזון והתרופות (FDA)-מאושר es, האנציכיה ליישומים מסחריים.
Abstract
המיקרואורגניזמים הם מגוונים מבחינה גנטית ומגוונות והפכו למקור עיקרי של מוצרים מסחריים רבים וביופרמצבטיקה. למרות שחלק מהמוצרים הללו מיוצרים באופן טבעי על ידי האורגניזמים, מוצרים אחרים דורשים הנדסה גנטית של האורגניזם כדי להגדיל את תפוקת הייצור. באופן מסורתי היתה המין החיידקי המועדף על הפקת הביו-פרמצבטיקה; עם זאת, מוצרים מסוימים קשים E. coli לייצר. כך, avirulent זנים של מינים חיידקיים אחרים יכול לספק חלופות שימושיות לייצור של כמה מוצרים מסחריים. פסאודומונס aeruginosa הוא חיידק משותף שלילי גראם שליליים שיכול לספק חלופה מתאימה ל -E. coli. למרות זאת, פ. אירויוגנוסה הוא פתוגן אנושי אופורטוניסטי. כאן, אנו מפרטים הליך שניתן להשתמש בו כדי ליצור זנים שאינם פתוגניים של P. aeruginosa באמצעות מחיקות גנומית רציפה באמצעות PEX100T-noti פלמיד. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא לייצר זן ללא סמן. שיטה זו עשויה לשמש להפקת מאוד מחליש P. aeruginosa זנים לייצור מוצרים מסחריים, או כדי לעצב זנים עבור שימושים ספציפיים אחרים. אנו מתארים גם מודל העכבר פשוט הניתן ל, של זיהום מערכתי חיידקי באמצעות הזרקה הצפק של זנים בדיקה מאומת כדי לבדוק את הנחת המתח מהונדסים גנטית בהשוואה לBL21 מאושר ה-FDA של E. coli.
Introduction
פסאודומונס aeruginosa הוא פתוגן בקטריאלי אופורטוניסטי שיכול לגרום סכנת חיים מחלות בבני אדם, במיוחד בתוך החיסוני. הפתוגניות של P. aeruginosa היא בשל ביטוי של גורמים התקפה אלימה רבים, כולל פרוטסים וליפופוליסכד, כמו גם את היכולת ליצור ביואלוilm הגנה1. בשל יכולתה לייצר גורמי התקפה אלימה ולגרום למחלות בבני אדם, באמצעות P. aeruginosa לעשות מוצרים מסחריים מציג חששות בטיחות. זנים שאינם פתוגניים של E. coli השתמשו באופן מסורתי כדי bioengineer מוצרים רפואיים ומסחריים לשימוש אנושי. עם זאת, מוצרים מסוימים קשים עבור E. coli לעשות, ורבים ארוזים בגופי הכללה, ביצוע מפרך החילוץ. זנים חיידקיים מהונדסים עם היכולת לבצע ולהפריש מוצרים ספציפיים הוא רצוי מאוד, כמו הפרשה צפויה להגדיל את התשואה ולהקל תהליכי טיהור. כך, זנים שאינם פתוגניים של מינים אחרים של חיידקים (למשל, מינים המשתמשים יותר הפרשה מסלולים) עשוי לספק חלופות שימושיות e. coli. לאחרונה דיווחו על התפתחות של מאמץ של P. aeruginosa, PGN5, שבו הפתוגניות ורעילות של האורגניזם הוא מאוד מחליש2. וחשוב מכך, זן זה עדיין מייצר כמויות גדולות של רב הסוכר, מרכיב מעניין מסחרית של ה -P. aeruginosa .
הזן PGN5 נוצר באמצעות שגרת allelic החלפת הליך עם pEX100T-NotI פלמיד כדי למחוק באופן רציף חמישה גנים (Toxa, plch, phzm wapr, aroa) ידוע לתרום הפתוגניות של האורגניזם. pEX100T-noti הופק על ידי שינוי smai הגבלת הגבלה noti אתר זיהוי אנזים בתוך האתר שיבוט מרובים של pEX100T פלמיד, אשר פותחה במעבדה של הרברט שוייצר3,4. אתר הזיהוי של האנזים ההגבלה NotI הוא רצף DNA נדיר יותר לעומת SmaI ופחות סביר להיות נוכח רצפים לשכפל, ולכן זה נוח יותר למטרות שיבוט. במרכז יש גנים המאפשרים בחירה, כולל הגן של בלה , אשר מקודד את ההתנגדות העצמית והcarbenicillin, ואת ה -b. Sub ssacb גן, אשר מקנה רגישות לסוכרוז (איור 1א). במרכז הפלמיד יש גם מקור שכפול (אורי) התואם ל -e. coli, ומקור העברה (אורית) המאפשר להעביר באמצעות החיידק הקולי למינים מסוג אי-האודומונס באמצעות קוניוגציה. עם זאת, הפלסמיד חסר מקור של שכפול תואם לפסאודומונס, ולכן אין באפשרותו לשכפל בתוך מינים פסבדו-דוממונס (כלומר, זהו וקטור התאבדות של פסבדו -פנים). מאפיינים אלה להפוך pEX100T-NotI אידיאלי עבור המיקוד מחיקות גנטיות מתוך כרומוזום הפסאודומונס . צעדי שיבוט פלמיד מתבצעים באמצעות E. coli והפלמיד התוצאה מועברת לפסאודומונס על ידי שינוי או קוניוגציה. לאחר מכן, באמצעות הומולוגי אירועים שילוב מחדש וצעדים סלקטיבית, מחיקה ממוקדת במסגרת מסגרת נוצרת, ללא סמן. שיטה זו של מחיקה ברציפות אזורים גנומית מן הכרומוזום של P. aeruginosa יכול לשמש כדי ליצור מאוד מחליש את הזנים של מאוד זני דוממונס , כמו PGN5, או כדי לעצב זנים עבור שימושים ספציפיים אחרים (למשל, זנים לקויה לאחר התפשטות פלסטלינה או זנים לקויה לייצור של חלבונים של עניין).
התקפה אלימה כוללת של זנים של חיידקים מושפעת מתנאי צמיחה ושלבים, במהלכו מוטציות מתרחשות לעתים קרובות. לכן, מדידת הבטיחות של זנים גנטית מהונדסים יכול להיות מאתגר. כדי להעריך מבודד חיידקי עבור התקפה אלימה מערכתית, התאמתי פרוטוקול שפורסם בעבר של זיהום על ידי הזרקה תוך הצפק של C57BL/6 עכברים5. שינו הליך זה כדי להשתמש מניות בקטריאלי קפוא להזרקה, אשר אפשרה עבור מינון מדויק ואימות קל של זנים המשמשים. במודל זה, החיידק E. coli BL21, אשר כבר אושרה על-ידי ה-FDA לייצור של ביו-פרמצבטיקה, שימש כתקן בטיחות שליטה לקביעת הפתוגנזה היחסית של הנבג6,7,8. היתרון העיקרי כדי להשתמש בשיטה זו היא כי הוא מתאחד וממזער מקורות של וריאציה, כמו זנים הדבקה מאומתים עבור מספר תא חיידקי, פנוטיפ, סמנים גנטיים הן לפני ואחרי זיהום. עם צעדים אלה מבוקרים, מספר בעלי החיים הנדרשים הוא מופחת. במודל זה, P. aeruginosa זנים הנובעים שיעורי תמותה C57BL/6 מורטין שווה או פחות מאשר E. coli BL21 כאשר מוזרק intraperitoneally עשוי להיחשב מחליש. זה מודל העכבר הפשוט של זיהום עשוי לשמש גם כדי להעריך את הפתוגניות החליש של זנים מהונדסים גנטית ממינים אחרים באמצעות ה-FDA שאושרו E. coli החומר כמו ההפניה. שלבים 1-7 לפרט את הדור של מחיקות גנומית רציפים ב P. aeruginosa (איור 1) ושלבים 8-12 לפרט את השימוש במודל העכבר כדי לבדוק את הפתוגניות של P. aeruginosa זנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
PEX100T-Not1 פלמיד הוא מתווך יעיל של מחיקות גנומית רציפה כי הם סמן חינם ו-מסגרת. כאשר זנים חיידקיים הנדסה עבור התקפה אלימה מחליש, מחיקה של רצפי גנים שלמים במקום לייצר מוטציות נקודה מקטין את הסבירות של הגירסה החוזרת לפנוטיפ המודבק. בנוסף, כל מחיקת הגנים הפתוגניות מחליש את הפתוגן עוד, ומחזקת את יצי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקים R44GM113545 ו P20GM103434.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
- Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
- Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
- Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
- Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).
- Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
- Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
- Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209 (2010).
- Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
- Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
- Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
- Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).
