Generierung von In-Frame-Gen-Deletion Mutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf VirulenzDämpfung in einem einfachen Mausmodell der Infektion

Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer bakterieller Erreger, der beim Menschen lebensbedrohliche Krankheiten verursachen kann, insbesondere bei immungeschwächten. Die Pathogenität von P. aeruginosa ist auf die Expression vieler Virulenzfaktoren, einschließlich Proteasen und Lipopolysaccharid, sowie seine Fähigkeit, einen schützenden Biofilm zu^{bilden, zurückzuführen.} Aufgrund seiner Fähigkeit, Virulenzfaktoren zu produzieren und Krankheiten beim Menschen verursachen, stellt die Verwendung von P. aeruginosa zur Herstellung kommerzieller Produkte Sicherheitsbedenken dar. Nichtpathogene Stämme von E. coli werden traditionell verwendet, um medizinische und kommerzielle Produkte für den menschlichen Gebrauch zu bioengineering. Jedoch, einige Produkte sind schwierig für E. coli zu machen, und viele sind in Inklusionsgremien verpackt, so dass Extraktion mühsam. Technische Bakterienstämme mit der Fähigkeit, bestimmte Produkte herzustellen und zu sezernieren, sind sehr wünschenswert, da die Sekretion wahrscheinlich die Ausbeute erhöhen und Reinigungsprozesse erleichtern würde. So können nicht pathogene Stämme anderer Bakterienarten (z. B. Arten, die mehr Sekretionswege nutzen) nützliche Alternativen zu E. coli bieten. Wir berichteten vor kurzem die Entwicklung eines Stammes von P. aeruginosa, PGN5, in dem die Pathogenität und Toxizität des Organismus stark abgeschwächt ist². Wichtig ist, dass dieser Stamm immer noch große Mengen des Polysaccharidalginats produziert, einem kommerziell interessanten Bestandteil des Biofilms P. aeruginosa.

Der PGN5-Stamm wurde mit einem zweistufigen Allelic-Austauschverfahren mit dem pEX100T-NotI-Plasmid erzeugt, um fünf Gene(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) sequenziell zu löschen, die bekanntermaßen zur Pathogenität des Organismus beitragen. pEX100T-NotI wurde durch die Umwandlung des SmaI in eine NotI-Restriktionsenzymerkennungsstelle innerhalb der Mehrfachklonstelle des Plasmids pEX100T erzeugt, die im Labor von Herbert Schweizer entwickelt wurde^3,4. Die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym NotI ist eine seltenere DNA-Sequenz im Vergleich zu SmaI und ist weniger wahrscheinlich in geklonten Sequenzen vorhanden, daher ist es für Klonzwecke bequemer. Das Plasmid trägt Gene, die eine Selektion ermöglichen, einschließlich des bla-Gens, das ß-Lactamase kodiert und Resistenzen gegen Carbenicillin verleiht, und das B. subtilissacB-Gen, das die Empfindlichkeit gegenüber Saccharose verleiht (Abbildung 1A). Das Plasmid trägt auch einen Ursprung der Replikation (ori) kompatibel mit E. coli, und einen Ursprung der Übertragung (oriT), die plasmid Transfer von E. coli zu Pseudomonas Arten über Konjugation ermöglicht. Dem Plasmid fehlt jedoch ein mit Pseudomonaskompatibler Replikationsursprung und kann daher innerhalb der Pseudomonas-Arten nicht replizieren (d. h. es handelt sich um einen Pseudomonas-Selbstmordvektor). Diese Eigenschaften machen pEX100T-NotI ideal für die gezielte genetische Deletion aus dem Pseudomonas-Chromosom. Plasmid-Klonschritte werden mit E. coli durchgeführt und das resultierende Plasmid wird durch Umwandlung oder Konjugation auf Pseudomonas übertragen. Dann wird durch homologe Rekombinationsereignisse und selektive Schritte die gezielte In-Frame-Deletion generiert, markerfrei. Diese Methode, genomische Regionen sequenziell aus dem Chromosom von P. aeruginosa zu löschen, könnte verwendet werden, um stark abgeschwächte Pseudomonas-Stämme wie PGN5 zu erzeugen oder Stämme für andere spezifische Anwendungen zu entwerfen (z. B. Stämme, die einen Mangel an Endonukleasen für die Plasmidvermehrung haben, oder Stämme, die einen Mangel an Proteasen für die Produktion von Proteinen von Interesse haben).

Die allgemeine Virulenz von Bakterienstämmen wird durch Wachstumsbedingungen und Phasen beeinflusst, in denen Mutationen häufig auftreten. Daher kann die Messung der Sicherheit gentechnisch veränderter Stämme eine Herausforderung darstellen. Um bakterielle Isolate auf systemische Virulenz zu untersuchen, haben wir ein zuvor veröffentlichtes Infektionsprotokoll durch intraperitoneale Injektion von C57BL/6-Mäusen⁵angepasst. Wir haben dieses Verfahren modifiziert, um gefrorene Bakterienvorräte für die Injektion zu verwenden, was eine präzise Beweichung und eine einfache Validierung der verwendeten Stämme ermöglichte. In diesem Modell wurde der E. coli-Stamm BL21, der von der FDA für die Herstellung von Biopharmazeutika zugelassen ist, als Kontrollsicherheitsstandard für die Bestimmung der relativen Pathogenese des Stammes^6,7,8verwendet. Der Hauptvorteil der Verwendung dieser Methode ist, dass es reproduzierbar ist und Variationsquellen minimiert, da infizierende Stämme für bakterielle Zellzahl, Phänotyp und genetische Marker sowohl vor als auch nach der Infektion validiert werden. Mit diesen kontrollierten Schritten wird die Anzahl der benötigten Tiere reduziert. In diesem Modell können P. aeruginosa-Stämme, die zu C57BL/6 murinen Sterblichkeitsraten von e. coli BL21 führen, wenn sie intraperitoneal injiziert werden, als abgeschwächt angesehen werden. Dieses einfache Mausmodell der Infektion kann auch verwendet werden, um die abgeschwächte Pathogenität von gentechnisch veränderten Stämmen anderer Arten unter Verwendung des von der FDA zugelassenen E. coli-Stamms als Referenz zu bewerten. In den Schritten 1-7 wird die Generierung sequenzieller genomischer Deletionen in P. aeruginosa (Abbildung 1) und die Schritte 8-12 detailliert die Verwendung eines Mausmodells zur Erprobung der Pathogenität von P. aeruginosa-Stämmen beschrieben.