Génération de mutants de suppression de gène dans le cadre dans Pseudomonas aeruginosa et essai pour l'atténuation de virulence dans un modèle simple de souris de l'infection

Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène bactérien opportuniste qui peut causer des maladies potentiellement mortelles chez l’homme, en particulier chez les immunocompromis. La pathogénie de P. aeruginosa est due à l’expression de nombreux facteurs de virulence, y compris les protéases et le lipopolysaccharide, ainsi que sa capacité à former un biofilm protecteur¹. En raison de sa capacité à produire des facteurs de virulence et à causer des maladies chez l’homme, l’utilisation de P. aeruginosa pour fabriquer des produits commerciaux pose des préoccupations en matière de sécurité. Les souches non pathogènes d’E. coli ont traditionnellement été utilisées pour bioingénieurr des produits médicaux et commerciaux à usage humain. Cependant, certains produits sont difficiles à fabriquer pour E. coli, et beaucoup sont emballés dans des organismes d’inclusion, ce qui rend l’extraction laborieuse. Les souches bactériennes modifiées avec la capacité de fabriquer et de sécrétiser des produits spécifiques est hautement souhaitable, car la sécrétion augmenterait probablement le rendement et faciliterait les processus de purification. Ainsi, les souches non pathogènes d’autres espèces de bactéries (p. ex., les espèces qui utilisent plus de voies de sécrétion) peuvent fournir des solutions de rechange utiles à E. coli. Nous avons récemment signalé le développement d’une souche de P. aeruginosa, PGN5, dans lequel la pathogénicité et la toxicité de l’organisme est fortement atténuée². Fait important, cette variété produit encore de grandes quantités de polysaccharide alginate, un composant commercialement intéressant du biofilm P. aeruginosa.

La souche PGN5 a été générée à l’aide d’une procédure d’échange allélique en deux étapes avec le plasmide pEX100T-NotI pour supprimer séquentiellement cinq gènes (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) connus pour contribuer à la pathogénie de l’organisme. pEX100T-NotI a été généré en changeant le SmaI à un site de reconnaissance d’enzymede de restriction notI dans le site multiple de clonage du plasmide pEX100T, qui a été développé dans le laboratoire d’Herbert Schweizer^3,4. Le site de reconnaissance de l’enzyme de restriction NotI est une séquence d’ADN plus rare par rapport à SmaI et moins susceptible d’être présent dans les séquences étant clonées, il est donc plus pratique pour les fins de clonage. Le plasmide porte des gènes qui permettent la sélection, y compris le gène bla, qui code la lactamase et confère une résistance à la carbenicilline, et le gène B. subtilissacB, qui confère une sensibilité au saccharose (Figure 1A). Le plasmide porte également une origine de réplication (ori) compatible avec E. coli, et une origine de transfert (oriT) qui permet le transfert de plasmide de E. coli à l’espèce Pseudomonas par conjugaison. Cependant, le plasmide n’a pas d’origine de réplication compatible avec Pseudomonas, et ne peut donc pas se répliquer chez les espèces Pseudomonas (c’est-à-dire qu’il s’agit d’un vecteur de suicide Pseudomonas). Ces caractéristiques font pEX100T-NotI idéal pour cibler les suppressions génétiques du chromosome Pseudomonas. Des étapes de clonage de plasmide sont effectuées à l’aide d’E. coli et le plasmide qui en résulte est transféré à Pseudomonas par transformation ou conjugaison. Puis, grâce à des événements de recombinaison homologues et des étapes sélectives, la suppression ciblée dans le cadre est générée, sans marqueur. Cette méthode de suppression séquentielle des régions génomiques du chromosome de P. aeruginosa pourrait être utilisée pour générer des souches pseudomonas fortement atténuées, comme PGN5, ou pour concevoir des souches pour d’autres utilisations spécifiques (par exemple, des souches déficientes en endodocules pour la propagation plasmide ou des souches déficientes en protéases pour la production de protéines d’intérêt).

La virulence globale des souches de bactéries est affectée par les conditions de croissance et les phases, au cours desquelles les mutations se produisent fréquemment. Par conséquent, il peut être difficile de mesurer l’innocuité des souches génétiquement modifiées. Pour évaluer les isolats bactériens pour la virulence systémique, nous avons adapté un protocole précédemment édité de l’infection par injection intrapéritonéale des souris de C57BL/6^5. Nous avons modifié cette procédure pour utiliser des stocks bactériens congelés pour l’injection, ce qui a permis un dosage précis et une validation facile des souches utilisées. Dans ce modèle, la souche E. coli BL21, qui a été approuvée par la FDA pour la production de produits biopharmaceutiques, a été utilisée comme norme de sécurité de contrôle pour déterminer la pathogénie relative de la souche^6,7,8. Le principal avantage de l’utilisation de cette méthode est qu’elle est reproductible et minimise les sources de variation, car les souches infectieuses sont validées pour le nombre de cellules bactériennes, le phénotype et les marqueurs génétiques avant et après l’infection. Avec ces étapes contrôlées, le nombre d’animaux requis est réduit. Dans ce modèle, les souches de P. aeruginosa qui entraînent des taux de mortalité par c57BL/6 murine s’un ou moins de E. coli BL21 lorsqu’elles sont injectées par voie intrapéritoyonnelle peuvent être considérées comme atténuées. Ce modèle simple d’infection de souris peut également être employé pour évaluer la pathogénicité atténuée des souches génétiquement modifiées d’autres espèces utilisant la souche E. coli approuvée par fda comme référence. Les étapes 1 à 7 détaillent la génération de suppressions génomiques séquentielles dans P. aeruginosa (figure 1) et les étapes 8-12 détaillent l’utilisation d’un modèle de souris pour tester la pathogénicité des souches de P. aeruginosa.