جيل من المتحولين في الإطار الجينات الحذف في الزائفة الزنجاريه واختبار لتوهين ضراوة في نموذج الماوس بسيطه من العدوى
Summary
هنا ، ونحن وصف بروتوكول بسيطه وقابله للتكرار من نموذج الماوس للعدوى لتقييم توهين السلالات المعدلة وراثيا من الزائفة الزنجاريه بالمقارنة مع الولايات المتحدة الغذاء والدواء أداره (FDA)-التي وافقت علي القولونية للتطبيقات التجارية.
Abstract
الكائنات المجهرية هي متعددة الأغراض وراثيا ومتنوعة وأصبحت مصدرا رئيسيا للعديد من المنتجات التجارية والbiopharmaceuticals. علي الرغم من ان بعض هذه المنتجات تنتج بشكل طبيعي من قبل الكائنات الحية ، والمنتجات الأخرى تتطلب الهندسة الوراثية للكائن الحي لزيادة غله الإنتاج. سلالات خبيثه من القولونية كانت تقليديا الأنواع البكتيرية المفضلة لإنتاج biopharmaceuticals; ومع ذلك ، بعض المنتجات من الصعب علي e. كولاي لإنتاج. وهكذا ، فان السلالات الخبيثة من الأنواع البكتيرية الأخرى يمكن ان توفر بدائل مفيده لإنتاج بعض المنتجات التجارية. الزائفة الزنجاريه هي بكتيريا سلبيه الجرام المشتركة ومدروسه جيدا التي يمكن ان توفر بديلا مناسبا ل e. كولاي. ومع ذلك ، الزنجاريه هو الممرض البشري الانتهازي. هنا ، ونحن التفاصيل الإجراءات التي يمكن استخدامها لتوليد سلالات غير المسببة للامراض من الزنجاريه من خلال الحذف الجيني متسلسلة باستخدام Plasmid pEX100T نؤتي. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي إنتاج سلاله خاليه من العلامات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد سلالات الزنجاريه موهنه للغاية لإنتاج المنتجات التجارية ، أو لتصميم سلالات لاستخدامات محدده أخرى. ونحن أيضا وصف نموذج الماوس بسيطه واستنساخه من العدوى الجهازية البكتيرية عن طريق حقن داخل الصفاق من سلالات اختبار المصادق عليها لاختبار التوهين من سلاله المهندسة وراثيا بالمقارنة مع سلاله BL21 المعتمدة من قبل FDA من e. كولاي.
Introduction
الزائفة الزنجاريه هو الممرض الجرثومي الانتهازية التي يمكن ان تسبب الامراض التي تهدد الحياة في البشر ، وخاصه في المناعة. ويرجع الامراضيه الزنجاريه إلى التعبير عن العديد من عوامل الضراوة ، بما في ذلك بروتياسيس و lipopolysaccharide ، فضلا عن قدرتها علي تشكيل بيوفيلم الواقية1. بسبب قدرتها علي إنتاج عوامل الضراوة وتسبب المرض في البشر ، وذلك باستخدام الزنجاريه لجعل المنتجات التجارية ويعرض المخاوف السلامة. السلالات غير المسببة للامراض من e. القولونية وقد استخدمت تقليديا للهندسة الحيوية المنتجات الطبية والتجارية للاستخدام البشري. ومع ذلك ، بعض المنتجات من الصعب علي e. كولاي لجعل ، والعديد من تعبئتها في هيئات الادراج ، مما يجعل استخراج شاقه. السلالات البكتيرية المهندسة مع القدرة علي صنع وإفراز منتجات محدده أمر مرغوب فيه للغاية ، كما إفراز من المرجح ان تزيد من الغلة وسهوله عمليات التنقية. وهكذا ، سلالات غير المسببة للامراض من الأنواع الأخرى من البكتيريا (علي سبيل المثال ، الأنواع التي تستخدم المزيد من مسارات إفراز) قد توفر بدائل مفيده ل e. كولاي. وقد أبلغنا مؤخرا عن تطور سلاله من الزنجاريه، PGN5 ، حيث الامراضيه وسميه الكائن الحي موهنه للغاية2. والاهم من ذلك ، لا تزال هذه السلالة تنتج كميات كبيره من الجينات السكاريد ، وهو مكون مثير للاهتمام من الناحية التجارية من p. الزنجاريه biofilm.
تم إنشاء سلاله PGN5 باستخدام اجراء تبادل اليليه من خطوتين مع pEX100T البلازميد لحذف بالتتابع خمسه الجينات (توكا، plch، phzm، wapr، aroa) المعروفة للمساهمة في الامراضيه الكائن الحي. تم توليد pEX100T-نؤتي عن طريق تغيير smai إلى موقع التعرف علي الانزيم نؤتي تقييد داخل موقع استنساخ متعددة من pEX100T البلازميد ، والتي وضعت في مختبر هربرت schweizer3،4. موقع الاعتراف لانزيم تقييد نؤتي هو تسلسل الحمض النووي النادرة مقارنه مع SmaI واقل احتمالا ان تكون موجودة في تسلسل يجري استنساخها ، التالي فانه هو أكثر ملاءمة لأغراض الاستنساخ. يحمل البلازميد الجينات التي تسمح للاختيار ، بما في ذلك الجينات bla ، والتي تقوم بترميز ß-lactamase ويمنح المقاومة لكاربينسيلين ، والجينات b. subtilissacb ، الذي يضفي حساسية لالسكروز (الشكل 1ا). كما يحمل البلازميد أصل النسخ المتماثل (ori) متوافق مع e. كولاي، واصل نقل (orit) الذي يسمح لنقل البلازميد من e. كولاي إلى الأنواع الزائفة عن طريق الاقتران. ومع ذلك ، فان البلازميد يفتقر إلى أصل النسخ المتماثل متوافقة مع الزائفة، التالي لا يمكن تكرار داخل الأنواع الزائفة (اي ، هو ناقلات الانتحار الزائفة ). هذه الخصائص تجعل pEX100T-نؤتي مثاليه لاستهداف المحذوفات الوراثية من كروموسوم الزائفة . يتم تنفيذ خطوات الاستنساخ البلازميد باستخدام e. كولاي ويتم نقل البلازميد الناتجة إلى الزائفة عن طريق التحويل أو الاقتران. ثم ، من خلال الاحداث أعاده تجميع المتماثلة والخطوات الانتقائية ، يتم إنشاء الحذف المستهدف في الإطار ، خاليه من العلامات. هذه الطريقة لحذف المناطق الجينية بالتتابع من كروموسوم الزنجاريه يمكن استخدامها لتوليد سلالات الزائفة الموهنة للغاية ، مثل PGN5 ، أو لتصميم سلالات لاستخدامات محدده أخرى (علي سبيل المثال ، سلالات نقص في الكريات الوحيدة النوى لانتشار البلازميد أو سلالات نقص في البرواسات لإنتاج البروتينات من الفائدة).
يتاثر الضراوة العامة لسلالات البكتيريا بظروف النمو والمراحل ، التي تحدث خلالها الطفرات بشكل متكرر. ولذلك ، فان قياس سلامه السلالات المهندسة وراثيا يمكن ان يكون صعبا. لتقييم العزلات البكتيرية لضراوة الجهازية ، ونحن تكييف بروتوكول نشرت سابقا من العدوى بواسطة حقن داخل الC57BL/6 الفئران5. قمنا بتعديل هذا الاجراء لاستخدام المخزونات البكتيرية المجمدة للحقن ، والتي سمحت بالجرعات الدقيقة وسهوله التحقق من السلالات المستخدمة. في هذا النموذج ، تم استخدام BL21 سلاله e. القولونية ، التي تمت الموافقة عليها من قبل أداره الاغذيه والعقاقير لإنتاج biopharmaceuticals ، كمعيار سلامه التحكم لتحديد المرض النسبي لسلاله6،7،8. الميزة الرئيسية لاستخدام هذا الأسلوب هو انه هو استنساخ ويقلل من مصادر الاختلاف ، كما يتم التحقق من صحة سلالات عدوي لرقم الخلية البكتيرية ، والنمط الظاهري ، وعلامات وراثيه قبل وبعد العدوى. مع هذه الخطوات التي تسيطر عليها ، يتم تقليل عدد الحيوانية المطلوبة. في هذا النموذج, الزنجاريه سلالات التي تؤدي إلى معدلات الوفاات MURINE C57BL/6 مساويه أو اقل من e. كولاي BL21 عند حقن داخل الصفاق يمكن اعتبار الموهن. ويمكن أيضا استخدام هذا النموذج البسيط الماوس للعدوى لتقييم الامراضيه الموهن من سلالات المهندسة وراثيا من الأنواع الأخرى باستخدام سلاله e. القولونية التي وافقت عليها الهيئة كمرجع. الخطوات 1-7 التفاصيل الجيل من الحذف الجينوم متسلسلة في الزنجاريه (الشكل 1) والخطوات 8-12 التفاصيل استخدام نموذج الماوس لاختبار الامراضيه سلالات الزنجاريه .
Protocol
Representative Results
Discussion
PEX100T-Not1 البلازميد هو وسيط فعال لحذف الجينوم المتسلسلة التي هي خاليه من العلامات وفي الإطار. عند هندسه سلالات بكتيرية لضراوة موهنه ، فان حذف متواليات الجينات بأكملها بدلا من توليد طفرات النقطة يقلل من احتماليه الارتداد إلى النمط الظاهري الخبيث. بالاضافه إلى ذلك ، كل حذف الجينات الامراضيه ي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم من المعاهد الوطنية للصحة التي تمنح R44GM113545 و P20GM103434.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
- Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
- Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
- Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
- Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).
- Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
- Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
- Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209 (2010).
- Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
- Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
- Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
- Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).
