Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

Los pasos descritos a continuación han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) UCSF. 1. Colonización gastrointestinal de ratones con C. albicans usando Gavage Oral Proporcionar alojamiento para ratones masculinos o femeninos de 18 a 21 g (8 a 10 semanas de edad) según lo aprobado por la IACUC local. Utilice alimentos y agua autoclave a partir del primer día.NOTA: El uso de jaulas esterilizadas, ropa de cama, alimentos y agua reduce el riesgo de contaminación con bacterias ambientales resistentes a los antibióticos que potencialmente pueden desplazar a C. albicans del intestino. Además, dependiendo de la cuestión experimental, se debe considerar la vivienda individual de los animales porque los ratones son coprofágicos y el contenido intestinal se compartirá entre los animales coalojados. Al día siguiente, reemplace el agua potable autoclave por agua autoclave que contenga 5% de glucosa, 1.500 U/ml de penicilina G y 2 mg/ml de estreptomicina. Para mayor comodidad, prepare 200x soluciones de stock antibiótico(Tabla 1) de antemano, filtre el filtro y congele a -20 oC. Mantener a los animales con antibióticos durante una semana. Los días 3 y 6 después de que se hayan iniciado los antibióticos, evalúe las heces de cada animal para detectar la contaminación con bacterias aeróbicas resistentes a los antibióticos. Sosteniendo un animal con una mano, coloque un tubo de microfuga sin acobardarse cerca del ano y recoja al menos un pellet fecal. Resuspenda cada gránulo fecal en 1 ml de agua estéril y placa 100 l sobre caldo de luria (LB), dextnrosa de peptona de extracto de levadura (YEPD) o infusión de corazón cerebral (BHI) más placas de agar en sangre. Incubar las placas durante la noche en una incubadora estándar (no anaeróbica) a 37 oC y evaluar el crecimiento bacteriano.NOTA: Las placas deben presentar un crecimiento mínimo (0-20 colonias). Si >20 colonias de bacterias se recuperan de animales tratados con penicilina y estreptomicina, entonces es poco probable que se establezca la colonización de alto nivel con C. albicans y se aborte el experimento. Tres días antes del gavage, la raya C. albicans de las existencias de glicerol congelado a YEPD + 2% placas de agar e incubar a 30 oC durante 2 días. Un día antes del gavage, inocular una colonia de cada cepa de C. albicans para ser probada en 5 mL de YEPD líquido. Incubar a 30oC durante la noche con temblores. La mañana de gavage, diluir el cultivo saturado de C. albicans a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,1 en 100 mL de YEPD precalentado a 30 oC. Agitar en un agitador orbital a 200 rpm a 30oC durante entre 4 h y 5 h hasta que OD600 alcance 1 (crecimiento medio del registro). Transfiera cada cultivo de 100 ml a dos tubos cónicos de 50 ml y centrífuga a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).NOTA: C. albicans se propaga relativamente lentamente en RT. Si se adapta este protocolo para otra especie, es posible que sea necesario mantener la inócula en el hielo para evitar un crecimiento continuo. Deseche el sobrenadante, resuspenda las células peletizadas en 20 ml de solución salina estéril por 50 ml de cultivo, y ate los gránulos resuspendidos duplicados en tubos cónicos individuales. Centrífuga a 3.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda en 20 ml de solución salina estéril. Vortex brevemente y retire 20 l para la medición de OD600. Diluir 1:50 en solución salina normal estéril. Centrifugar las celdas resuspendidas restantes a 3.000 x g durante 5 min. Descarta el sobrenadante. Para un tamaño de inóculo de 1 x 108 CFU, resuspenda las células peletadas a aproximadamente 5 x 108 UFC/ml en solución salina normal estéril basada en la concentración estimada determinada a partir de la mediciónde 600 OD.NOTA: Típicamente, una OD600 de 1 corresponde a 1 x 107 células de levadura/ml. Este valor puede variar según el espectrofotómetro y debe verificarse. Si se desea un cambio en la concentración para las infecciones con un microorganismo diferente, planifique un volumen de inóculo de un ratón de 10 l/g para minimizar las molestias al animal. Verifique la concentración del inóculo contando una dilución de 1:1.000 con un hemocítómetro. Ajuste el volumen de las células a gavaged en función de la concentración determinada utilizando el hemocítómetro. Usando una aguja de alimentación animal(Figura 1A), envaina cada animal con el volumen calculado de un inóculo dado. Vea los pasos 1.13.1-1.13.8 para el procedimiento gavage.NOTA: La formación para el gavage debe obtenerse de un profesional con experiencia, y el procedimiento debe dominarse con antelación. Un procedimiento exitoso para un solo animal normalmente no toma más de 1 min. Coloque una aguja autoclave para la alimentación de animales en una jeringa de 1 ml y llene la jeringa con un volumen de gavage, eliminando cualquier burbuja de aire para evitar una dosis inexacta. Colocar sobre una superficie estéril. Asegure al animal para gavage. Sostenga al animal en la base de la cola con la mano dominante y deslice la mano no dominante hacia la espalda del animal hasta la piel suelta justo detrás de las orejas. Usando el dedo índice y el pulgar de la mano no dominante, juntar la piel suelta firmemente; este es el “scruff”. Recoger al animal por su dedo pequeño de scruff y bucle de la misma mano (no dominante) alrededor de la cola para inmovilizar al animal contra la palma de la mano. Extiéndase suavemente la cabeza del animal para que su cabeza y cuerpo (y por lo tanto cuello y esófago) estén en línea recta.NOTA: Intentar un gavage mientras el cuerpo del animal está doblado o retorcido puede resultar en complicaciones tales como perforación esofágica y muerte del animal. Recoja la jeringa con la mano dominante y sostenga perpendicular al animal, con la aguja curva da hacia abajo(Figura 1B). Usando la bola de la aguja, enganche suavemente una esquina interior de la boca, avance suavemente la aguja a lo largo del lado de la boca hasta la parte posterior de la garganta, y finalmente mueva la aguja hacia el centro.NOTA: La introducción de la aguja a lo largo de un camino lateral ayuda a evitar la resistencia de los dientes y la lengua del animal. Una vez que la bola de la aguja está en la parte posterior de la garganta, incline la aguja hacia arriba para que sea paralela a la línea del cuerpo del animal(Figura 1C).NOTA: En este punto, el animal exhibirá un reflejo de mordaza. Esto es una buena señal que indica que la aguja está colocada correctamente, y el movimiento de mordaza ayuda a guiar la aguja por el esófago. Si no hay reflejo de mordaza, la aguja puede estar en la tráquea en lugar del esófago. Retire suavemente la aguja y vuelva al paso 1.13.1. Deje que el animal trague el inóculo hasta que sólo unos pocos milímetros permanezcan visibles(Figura 1D). Avance la aguja suavemente.NOTA: Si la aguja no avanza, evite usar la fuerza, que puede dañar el esófago. A veces avanzar el último medio centímetro requerirá una mordaza extra grande del animal. Si la aguja parece estar atascada, retírela lentamente e inténtelo de nuevo desde el paso 1.13.4. Compruebe que la bola de aguja se encuentra en la ubicación correcta (estómago) avanzando suavemente el émbolo. Si no hay resistencia, continúe entregando el inóculo. Una vez administrado el inóculo, retire lentamente la aguja. Sustituya al animal en su jaula y continúe monitoreando al animal durante 5 a 10 minutos en busca de signos de respiración o angustia laboriosa. Verifique que el animal reanude la actividad normal poco después del gavage. Si se utilizará el mismo inóculo con el siguiente animal, limpie la aguja con una toallita con alcohol. Proceda a la etapa 1.13.1. Si se utilizará un inóculo diferente, utilice una aguja nueva y vuelva al paso 1.13.1.NOTA: Es importante inspeccionar los animales al día siguiente del gavage. Los animales que presenten signos de angustia (por ejemplo, postura encorvada, respiración trabajada) deben ser eutanasiados humanamente, ya que probablemente han sufrido ruptura esofágica, daño a los pulmones u otra lesión interna de la que es poco probable recuperarse. Tras el avalado de los animales, diluciones de placas de la inócula para la verificación de la dosis. Preparar diluciones seriales de 10 veces hasta 1:105. Placa uno volumen de gavage de la dilución 1:105 en una placa de 100 mm de agar dextrosa Sabouraud. Incubar la placa durante 2 días a 30oC. Contar las UFC para confirmar la dosis de inóculo. 2. Preparación de tejidos gastrointestinales para la histología NOTA: Esta sección del protocolo está adaptada de Johansson y Hansson16. Preparar 500 ml de solución de metacarn (60% metanol, 30% cloroformo, 10% ácido acético glacial) en un frasco de plástico de tapa de tornillo grande por cada 2 animales diseccionados.PRECAUCION: El metanol y el cloroformo son dañinos si se inhalan y deben manipularse en una campana química. El ácido acético glacial puede ser corrosivo y debe manipularse con el equipo de protección personal adecuado. El metanol, el cloroformo y el ácido acético glacial deben desecharse como residuos peligrosos. En el punto final experimental, eutanasia a los animales humanamente de acuerdo con un protocolo aprobado por la IACUC local.NOTA: En animales tratados con antibióticos, la colonización de C. albicans suele oscilar entre 106 UFC/g en el día 5 y 5 x 107 UFC/g para el día 25. Esterilice las herramientas de disección con un 10% de lejía y enjuague con 70% de etanol. Fije a cada animal a una superficie de disección, con el lado ventral hacia arriba. Utilice agujas de 30 G para fijar las extremidades a la superficie de la disección(Figura 2A). Rocíe al animal con 70% de etanol para limpiar el pelaje y minimizar la adherencia a las herramientas. Con fórceps contundentes, pellizca una sección de la piel abdominal con la mano no dominante. Usando tijeras con la mano dominante, incise la piel y la fascia subyacente cerca de la base de la pelvis. Extienda la incisión en forma de U a lo largo de cada lado de la cavidad peritoneal y hasta la caja torácica. Levanta la piel del camino. Usando un lápiz, preetiquetar casetes de histología para los segmentos de GI que se evaluarán. Por ejemplo, para cada animal, etiquete los casetes separados como “estómago”, “intestinos delgados proximales”, “intestinos delgados medios”, “intestinos delgados distales”, “cecum” e “intestinos grandes”. Coloque una almohadilla de espuma en la parte inferior de cada cassette(Figura 2A).NOTA: La Figura 2B describe las secciones sugeridas para colocar en casetes. Usando fórceps contundentes, extraiga suavemente el cecum de la cavidad peritoneal. Use tijeras para cortar las conexiones entre el cecum y los intestinos pequeños y grandes.NOTA: El tejido cecal es muy delicado y fácil de romper. Tenga cuidado al manipular. Coloque todo el cecum en un casete histológico para que quede sin torcer y se aplana plana(Figura 2C). Coloque una segunda almohadilla de espuma en la parte superior y cierre el cassette. Coloque el cassette en un frasco de tapa de tornillo que contenga metacarnes. Especiales una sección de los intestinos gruesos que contiene 1 x 2 gránulos fecales, con una longitud inferior a la del cassette. Coloque la sección de tejido en el cassette, manteniendo el tejido plano y sin torcer. Superponer con una segunda almohadilla de espuma y cerrar el cassette. Coloque el cassette en metacarn. Para cada sección del intestino delgado a tomar muestras, exboe un segmento de 1 x 2 cm que contenga algún material digestivo. Coloque el segmento en un casete de histología, manteniendo el tejido plano y sin torcer. Superponer con una segunda almohadilla de espuma y cerrar el cassette. Coloque el cassette en metacarn. Para el estómago, cortar las conexiones con el esófago y el intestino delgado. Colocar en un cassette, manteniendo el tejido plano y sin torcer. Superponer con una segunda almohadilla de espuma y cerrar el cassette. Coloque el cassette en metacarn. Deje los cassettes en solución de metacarn en RT durante al menos 3 h y menos de 2 semanas.NOTA: Hay varios puntos durante los cuales los segmentos de indicación geográfica fija se pueden transferir a un servicio de histología comercial. Estos tejidos pueden ser difíciles de seccionar sin interrupción del contenido luminal, y los resultados óptimos serán obtenidos por un técnico experimentado. Si el servicio comercial está dispuesto a realizar lavados antes de incrustar los tejidos en parafina, los casetes se pueden enviar en esta etapa junto con las instrucciones para el paso 2.16. Comienza a fundir suficiente cera de parafina para cubrir todos los casetes de tejido en un vaso de precipitados grande en un horno de hibridación precalentado de 70 oC. Después de la fijación, retire las almohadillas de espuma y devuelva cada sección de tejido intacta a su casete. Lavar los tejidos con las siguientes soluciones a RT con agitación: dos veces durante 35 min en 100% metanol, dos veces por 25 min en 100% etanol, dos veces durante 20 min en xileno.PRECAUCION: El xileno es inflamable, tóxico y puede causar daños si se inhala. Uso en una campana química con la protección adecuada. Deseche el xileno mediante procedimientos de residuos peligrosos. Seque los cassettes sobre una toalla de papel y colóquelos en cera de parafina prefundida durante 2 h a 70 oC en un horno de hibridación. Asegúrese de que los cassettes estén llenos de parafina y de que no queden burbujas.NOTA: Este paso permite que la cera se infiltre en el segmento GI y estabilice el tejido y el contenido. Retire los cassettes de la cera, deje que el exceso de cera drene y guárdelos en RT hasta que estén incrustados en bloques de cera. Deseche la cera que contiene trazas de xilenos como residuos peligrosos.NOTA: El Noble Lab utiliza un servicio de histología comercial para la incrustación y seccionamiento de tejidos. Para la visualización estándar de levaduras de C. albicans e hifas, se utilizan secciones de 4 m. Para evaluar la conectividad de los segmentos hiplócores, que normalmente se extienden a través de varios planos, se pueden utilizar secciones de 8 m. Dependiendo de la capacidad de las sondas FISH para penetrar en la muestra, puede ser posible utilizar secciones aún más gruesas. 3. Validación de sondas de nuevo diseño NOTA: El siguiente protocolo para validar las sondas C. albicans fue adaptado de Swidsinski et al.17. Streak C. albicans SC5314 y especies de comparadores estrechamente relacionadas (por ejemplo, Candida dubliniensis, Candida tropicalis)a YEPD + 2% placas de agar. Incubar durante 1 o 2 días a 30oC. Inocular 5 ml de medio líquido YEPD con una sola colonia. Pipetear 1 ml de las células suspendidas a un tubo de microcentrífuga y centrífuga a 3.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspenda el gránulo en 100 ml de solución salina con fosfato (PBS). Pipetear 5 x 10 l de células resuspendidas y detectar sobre un portaobjetos de vidrio. Seextiende en un círculo más grande y deja secar.NOTA: Si las células no son adherentes, utilice diapositivas recubiertas de poli-L-lisina. Círculo del punto de celda con una pluma PAP y cubrir con 50 éL de 2.5% de paraformaldehído (PFA) en PBS. Incubar a RT durante 10 min.PRECAUCION: La PFA es inflamable y puede causar problemas de salud si se inhala o está en contacto con la piel. Los artículos contaminados con PFA deben desecharse como residuos peligrosos. Lavar 3x con PBS. Toque el líquido en la toalla de papel y cúbralo con 100 ml de PBS. Repita dos veces. Deseche el lavado final. Prepare diapositivas para almacenamiento de varios días. Si realiza FISH el mismo día, continúe con el paso 3.9 sin los pasos de esta sección.NOTA: Es preferible realizar la hibridación inmediatamente, pero si tiene poco tiempo, siga el paso 3.8 antes de almacenar. Las diapositivas se pueden almacenar durante varios días a 4 oC. Cubra el lugar con 60% de etanol. Incubar a RT durante 3 min. Deseche la solución. Cubra el lugar con 80% de etanol. Incubar a RT durante 3 min. Deseche la solución. Cubra el lugar con 100% de etanol. Incubar a RT durante 3 min. Deseche la solución. Continúe con el paso 3.9. Colocar las diapositivas descubiertas en un horno de hibridación a 50oC durante 1 h. Si se siguió el paso 3.8, guarde las diapositivas a 4 oC. Si no, proceda al paso 4.2 para realizar el protocolo de hibridación. 4. FISH Sstaining en los tejidos del tracto gastrointestinal Secciones histológicas incrustadas en parafina de dewax. En un horno de hibridación, precalienta un frasco de Coplin lleno de xileno a 60oC. Inserte las diapositivas en el frasco lleno de xileno. Colocar a 60oC durante 10 min. Deseche el lavado de xileno. Mantenga las diapositivas en el frasco y vierta el xileno en un contenedor de residuos. Vierta el xileno FRESCO en el frasco e incubar a 60 oC durante 10 min. Deseche el segundo lavado de xileno. Llene el frasco con 100% de etanol e incubar a RT durante 5 min. Retire los portaobjetos del frasco y seque al aire. Establezca el horno de hibridación en 50oC para los pasos de la sección 4.2. Mancha C. albicans con la sonda FISH. Preparar 1 ml de solución de hibridación fresca (20 mM Tris–HCl, pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.1% de dodecilo sulfato de sodio [SDS], 1% de formación en agua libre de RNase). Consulte el Cuadro 1 para ver los cálculos de muestra. Mezclar 50 l de solución de hibridación con 1 l de sonda C. albicans (5′ Cy3- ACAGCAGAAGCCGTGCC 3′; 50 g/mL en agua libre de RNase) para una cantidad final de sonda de 0,5 g por diapositiva.NOTA: Muchos ratones criados en laboratorio no contienen hongos entre su microbiota. En este caso, es posible sustituir una sonda panfúngica (5′ Cy3-CTCTCTCTTCACCCTATTC 3′) que reconoce 23S rRNA de la mayoría de las especies de hongos, no sólo C. albicans. En la experiencia de los autores, la sonda panfógica produce una tinción más brillante que la sonda específica de C. albicans. Proteja la solución de la luz y del precalentamiento a 50 oC. Con un bolígrafo PAP, dibuje un círculo alrededor de la sección 4.1. Pipetear 50 l de solución de hibridación que contiene sondas sobre el tejido fijo y se extiende suavemente sobre la sección del tejido con una punta de pipeta. Superponga el líquido con un cubreobjetos de hibridación asegurándose de evitar burbujas. Selle los portaobjetos en una cámara de hibridación estanca e incubar las secciones durante 3 h a 50oC en la oscuridad en un horno de hibridación. Mientras tanto, prepare 50 ml de solución de lavado FISH (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl en agua libre de RNase). Consulte el Cuadro 1 para ver los cálculos de muestra. Mueva la solución de lavado a 50 oC al precalentamiento. Después de las 3 h, agregue la solución de lavado a un frasco de Coplin. A continuación, retire cuidadosamente el cubreobjetos de la corredera con fórceps y coloque el portaobjetos en la solución de lavado. Cubrir el frasco con papel de aluminio e incubar a 50oC durante 20 min. Durante esta incubación, preparar la solución de tinción de mucina-nuclei (20 ng/ml 4o,6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI], 1,6 g/ml de fluoresceína isotiocianato [FITC]-lectina en PBS). Consulte el Cuadro 1 para ver los cálculos de muestra. Para el estómago y los intestinos gruesos, utilice FITC-Ulex europaeus aglutinina 1 (UEA-1). Para los intestinos delgados y el cecum, utilice una combinación de aglutinina de germina germinal de trigo FITC-UEA-1 y FITC(WGA).NOTA: Las lectinas de diferentes especies reconocen diferentes modificaciones del azúcar de las glicoproteínas como la mucina. Las combinaciones de lectina recomendadas aquí se determinaron empíricamente para la tinción óptima de moco en diferentes compartimentos gastrointestinales. Lave los portaobjetos vertiendo la solución de lavado FISH y rellenando el frasco con RT PBS. Vierta el PBS inmediatamente y rellene con PBS. Vierta el PBS para un total de 2 lavados. Extraiga el PBS con un delicado tejido limpiaparabrisas y circule la sección del tejido intestinal con una pluma PAP. Coloque las diapositivas en un recipiente de plástico opaco y agregue 50 ml de solución de tinción de mucina-nuclei a la sección de tejido. Cubra el recipiente con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Incubar a 4oC durante 45 min. Coloque las diapositivas en un frasco de Coplin y lávelas rápidamente dos veces en PBS en RT. Toque el exceso de PBS en una toalla de papel y, a continuación, reseque las gotas finales de PBS con un pañuelo. Coloque una gota de medio de montaje en cada sección y superponga con un cubreobjetos de vidrio, evitando burbujas. Deje que el medio de montaje se extienda por debajo de toda la cubierta. Para obtener imágenes inmediatas, ancle el cubreobjetos en su lugar con esmalte de uñas en las esquinas. Para el almacenamiento a largo plazo, cierre alrededor de la cubierta con esmalte de uñas. Imagen de las diapositivas con un microscopio fluorescente.