Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

As etapas descritas abaixo foram aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSF (IACUC). 1. Colonização gastrointestinal de camundongos com c. albicans usando gavage oral Fornecer moradia para camundongos machos ou fêmeas de 18 a 21 g (8 a 10 semanas de idade), conforme aprovado pelo IACUC local. Use comida autocllavada e água a partir do primeiro dia.Nota: O uso de gaiolas esterilizadas, cama, alimentos e água reduz o risco de contaminação com bactérias ambientais resistentes a antibióticos que podem potencialmente deslocar c. albicans do intestino. Além disso, dependendo da questão experimental, a habitação individual dos animais deve ser considerada porque os ratos são coprofafagos e o conteúdo intestinal será partilhado entre os animais coalojados. No dia seguinte, substitua a água potável autocllavada por água autocllavada contendo 5% de glicose, 1.500 U/mL penicilina G e 2 mg/mL de estreptomicina. Por conveniência, prepare soluções de estoque de antibióticos 200x(Tabela 1) com antecedência, filtre esterilizar e congelar a -20 °C. Manter animais em antibióticos por uma semana. Nos dias 3 e 6 após o início dos antibióticos, avalie as fezes de cada animal quanto à contaminação por bactérias aeróbicas resistentes a antibióticos. Segurando um animal com uma mão, coloque um tubo de microfúgio sem tampa perto do ânus e recolher pelo menos uma pelota fecal. Resuspende cada pelota fecal em 1 mL de água estéril e placa 100 μL em caldo de Luria (LB), extrato de levedura peptone dextrose (YEPD), ou infusão cardíaca cerebral (BHI) além de placas de ágar de sangue. Incubar as placas durante a noite em uma incubadora padrão (não anaeróbica) a 37 °C e avaliar para o crescimento bacteriano.Nota: As placas devem apresentar um crescimento mínimo (0 a 20 colônias). Se as colônias de bactérias forem recuperadas de animais tratados com penicilina e estreptomicina, então é improvável que a colonização de alto nível com c. albicans seja estabelecida e o experimento seja abortado. Três dias antes do gavage, raia C. albicans de estoques congelados de glicerol para YEPD + 2% placas de ágar e incubado a 30 °C por 2 dias. Um dia antes do gavage, inocular uma colônia de cada cepa c. albicans a ser testado em 5 mL de YEPD líquido. Incubar a 30 °C durante a noite com agitação. Na manhã do gavage, diluir a cultura saturada de C. albicans a uma densidade óptica em 600 nm (OD600)de 0,1 em 100 mL de YEPD pré-aquecido a 30 °C. Agite em um agitador orbital em 200 rpm em 30 °C para entre 4 h e 5 h até OD600 atinge 1 (crescimento mid-log). Transfira cada cultura de 100 mL para dois tubos cônicos de 50 mL e centrífuga a 3.000 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT).NOTA: C. albicans propaga relativamente lentamente em RT. Se adaptar este protocolo para outra espécie, o inocula pode precisar ser mantido no gelo para evitar o crescimento contínuo. Descarte o supernatant, resuspenda as pilhas pelleted em 20 mL do soro fisiológico estéril por 50 mL da cultura, e adreça as pelotas resuspended duplicadas em únicos tubos cónicos. Centrífuga a 3.000 x g por 5 min. Descarte o supernatant e resuspenda em 20 mL de sosseo estéril. Vortex brevemente e remover 20 μL para a medição od600. Diluir 1:50 em sisino normal estéril. Centrífuga as células resuspensas restantes a 3.000 x g por 5 min. Descarte o supernatant. Para um tamanho inoculum de 1 x 108 CFU, resuspenda as células pelleted para aproximadamente 5 x 108 CFUs/mL em soro soro normal estéril com base na concentração estimada determinada a partir da medição de OD600.Nota: Normalmente, um OD600 de 1 corresponde a ~ 1 x 107 células de levedura/mL. Esse valor pode variar de acordo com o espectrômetro e deve ser verificado. Se uma mudança na concentração é desejada para infecções com um microorganismo diferente, planeie para um volume do inoculum de ≤10 μL/g rato para minimizar o incómodo ao animal. Verifique a concentração do inóculo contando uma diluição de 1:1.000 com um hemocytometer. Ajuste o volume de células para ser gavaged com base na concentração determinada usando o hemocytometer. Usando uma agulha de alimentação animal (Figura 1A), gavage cada animal com o volume calculado de um inóculo dado. Veja os passos 1.13.1-1.13.8 para o procedimento de gavage.NOTA: O treinamento para gavage deve ser obtido de um médico experiente, e o procedimento deve ser dominado com antecedência. Um procedimento bem sucedido para um único animal normalmente não leva mais do que 1 minuto. Anexe uma agulha autocllavada de alimentação animal a uma seringa de 1 mL e encha a seringa com um volume de gavage, removendo quaisquer bolhas de ar para evitar uma dose imprecisa. Coloque em uma superfície estéril. Proteger o animal para gavage. Segure o animal na base da cauda com a mão dominante e deslize mão não dominante até as costas do animal para a pele solta logo atrás das orelhas. Usando o indicador e o polegar da mão não dominante, reúna a pele solta firmemente; esta é a “nuca”. Pegue o animal por sua nuca e loop pequeno dedo da mesma mão (não dominante) ao redor da cauda para imobilizar o animal contra a palma da mão. Gentilmente estender a cabeça do animal para que sua cabeça e corpo (e, portanto, pescoço e esôfago) estão em linha reta.Nota: Tentar um gavage quando o corpo do animal for dobrado ou torcido pode conduzir às complicações tais como a perforation e a morte eosfêticas do animal. Pegue a seringa com a mão dominante e segure perpendicular ao animal, com a agulha curva apontando para baixo (Figura 1B). Usando a bola da agulha, gentilmente gancho um canto interior da boca, avançar suavemente a agulha ao longo do lado da boca para a parte de trás da garganta, e, finalmente, mover a agulha para o centro.Nota: Introduzir a agulha ao longo de um caminho lateral ajuda a evitar a resistência dos dentes e da língua do animal. Uma vez que a bola da agulha está na parte de trás da garganta, incline a agulha para cima para que seja paralelo com a linha do corpo do animal(Figura 1C).Nota: Neste ponto, o animal vai exibir um reflexo de vômito. Este é um bom sinal que indica que a agulha está posicionada corretamente, e o movimento de engasgos ajuda a guiar a agulha para baixo do esôfago. Se não houver reflexo de vômito, a agulha pode estar na traqueia em vez do esôfago. Retire suavemente a agulha e volte ao passo 1.13.1. Permita que o animal engula o inóculo até que apenas alguns milímetros permaneçam visíveis(Figura 1D). Avance a agulha sem problemas.Nota: Se a agulha não avançar, evite usar a força, o que pode danificar o esôfago. Às vezes, avançando o centímetro último meio vai exigir uma mordaça extra-grande do animal. Se a agulha parece estar preso, retire-a lentamente e tente novamente a partir do passo 1.13.4. Teste que a bola de agulha está no local correto (estômago) por avançar suavemente o desentupidor. Se não houver resistência, continue entregando o inóculo. Uma vez que o inóculo foi administrado, retire lentamente a agulha. Substitua o animal em sua gaiola e continue a monitorar o animal por 5 a 10 min em busca de sinais de respiração ou angústia trabalhada. Verifique se o animal retoma a atividade normal logo após gavage. Se o mesmo inóculo será usado com o próximo animal, limpe a agulha com uma limpeza de álcool. Volte ao passo 1.13.1. Se um inóculo diferente será usado, use uma agulha nova e prossiga para trás à etapa 1.13.1.Nota: É importante inspecionar animais no dia seguinte ao gavage. Os animais que exibem sinais de angústia (por exemplo, postura curvada, respiração laboriosa) devem ser sacrificados humanamente, pois provavelmente sofreram ruptura esôfaga, danos nos pulmões ou outra lesão interna da qual a recuperação é improvável. Após o gavage dos animais, diluições da placa do inocula para a verificação da dose. Prepare diluições em série de 10 vezes até 1:105. Placa um volume de gavage da diluição de 1:105 em uma placa de 100 mm de Sabouraud dextrose agar. Incubar a placa por 2 dias a 30 °C. Conte CFUs para confirmar a dose de inóculo. 2. Preparação de tecidos gastrointestinais para histologia Nota: Esta seção do protocolo é adaptada de Johansson e Hansson16. Prepare 500 mL de solução de metacarn (60% metanol, 30% clorofórmio, 10% ácido acético glacial) em um frasco de plástico de grande tampa de rosca para cada 2 animais dissecados.CUIDADO: O metanol e o clorofórmio são prejudiciais se inalados e devem ser manipulados em uma capa química. O ácido acético glacial pode ser corrosivo e deve ser manuseado com o equipamento de proteção pessoal adequado. O metanol, o clorofórmio e o ácido acético glacial devem ser descartados como resíduos perigosos. No ponto final experimental, eutanasiar os animais humanamente de acordo com um protocolo aprovado pela IACUC local.Nota: Em animais tratados com antibióticos, a colonização de C. albicans normalmente varia de ~106 CFUs/g no dia 5 até ~5 x 107 CFUs/g até o dia 25. Esterilizar ferramentas de dissecação com 10% de lixívia e enxaguar com 70% de etanol. Fixe cada animal a uma superfície da dissecação, com o lado ventral que enfrenta acima. Use 30 agulhas G para proteger os membros da superfície da dissecação(Figura 2A). Pulverizar o animal com 70% de etanol para limpar a pele e minimizar a degola para as ferramentas. Usando fórceps contundentes, beliscar uma seção da pele abdominal com a mão não dominante. Usando tesoura com mão dominante, incisar a pele e fascia subjacente perto da base da pelve. Estender a incisão em forma de U ao longo de cada lado da cavidade peritoneal e até a caixa torácica. Retire a pele do caminho. Usando um lápis, de histologia pré-rotular para os segmentos gi a ser avaliado. Por exemplo, para cada animal, rotular separadas como estômago, intestino delgado proximal, intestino delgado médio, intestino delgado distal, cécum e intestino grosso. Coloque uma almofada de espuma na parte inferior de cada (Figura 2A).NOTA: Figura 2B descreve seções sugeridas para colocar em. Usando fórceps contundentes, extrai suavemente o cecum da cavidade peritoneal. Use uma tesoura para cortar conexões entre o cécum e os intestinos delgados e grossos.Nota: O tecido cecal é muito delicado e fácil de romper. Tome cuidado ao manipular. Coloque todo o em uma histológica para que ele seja destorcido e fica plano(Figura 2C). Coloque uma segunda almofada de espuma por cima e feche o. Coloque a fita em um frasco de tampa de rosca contendo methacarn. Excise uma seção dos intestinos grossos que contem 1-2 pelotas fecais, com um comprimento menos do que aquele da gaveta. Coloque a seção de tecido na fita, mantendo o tecido plano e destorcido. Sobreposição com uma segunda almofada de espuma e feche o. Coloque a fita em methacarn. Para que cada seção do intestino delgado seja amostrada, excise um segmento de 1 a 2 cm que contenha algum material digestivo. Coloque o segmento em uma fita histológica, mantendo o tecido plano e destorcido. Sobreposição com uma segunda almofada de espuma e feche o. Coloque a fita em methacarn. Para o estômago, cortar as conexões com o esôfago e intestino delgado. Coloque em uma fita, mantendo o tecido plano e destorcido. Sobreposição com uma segunda almofada de espuma e feche o. Coloque a fita em methacarn. Deixe as em solução de metacarn em RT por pelo menos 3 h e menos de 2 semanas.Nota: Existem vários pontos durante os quais os segmentos de IG fixos podem ser transferidos para um serviço de histologia comercial. Estes tecidos podem ser difíceis de seção sem interrupção do conteúdo luminal, e os resultados ideais serão obtidos por um técnico experiente. Se o serviço comercial está disposto a realizar lavagens antes de incorporar os tecidos em parafina, as podem ser enviadas nesta fase, juntamente com instruções para o passo 2.16. Comece a derreter cera de parafina suficiente para cobrir todas as de tecido em um copo grande em um forno de hibridização pré-aquecido de 70 °C. Após a fixação, retire as almofadas de espuma e devolva cada seção intacta do tecido de volta em sua gaveta. Lave os tecidos com as seguintes soluções no RT com agitação: duas vezes por 35 min em 100% metanol, duas vezes por 25 min em 100% de etanol, duas vezes por 20 min em xileno.CUIDADO: Xileno é inflamável, tóxico, e pode causar danos se inalado. Use em uma capa química com proteção apropriada. Descarte de xileno através de procedimentos de resíduos perigosos. Pat as seca em uma toalha de papel e coloque em cera de parafina pré-derretido por 2 h a 70 ° C em um forno de hibridização. Certifique-se de que as fitas estão cheias de parafina e não restam bolhas.Nota: Esta etapa permite que a cera se infiltre no segmento gi e para estabilizar o tecido e o conteúdo. Retire as fitas de cera, permitir que o excesso de cera para drenar, e armazenar em RT até que estejam incorporados em blocos de cera. Descarte a cera contendo vestígios de xilenos como resíduos perigosos.Nota: O Noble Lab usa um serviço de histologia comercial para incorporar e secionar de tecidos. Para visualização padrão de leveduras e híteros c. albicans, 4 seções μm são usadas. Para avaliar a conectividade dos segmentos de hílgol, que normalmente se estendem por vários planos, 8 seções de μm podem ser usadas. Dependendo da capacidade das sondas FISH para penetrar no espécime, pode ser possível usar seções ainda mais espessas. 3. Validação de sondas recém-concebidas Nota: O seguinte protocolo para validar sondas c. albicans foi adaptado de Swidsinski et al.17. Streak C. albicans SC5314 e espécies de comparação intimamente relacionadas (por exemplo, Candida dubliniensis, Candida tropicalis) a YEPD + 2% placas de ágar. Incubar por 1-2 dias a 30 °C. Inocular 5 mL de yepd líquido médio com uma única colônia. Pipeta 1 mL das células suspensas para um tubo de microcentrífuga e centrífuga a 3.000 x g por 5 min. Descarte supernatant. Resuspenda a pelota em 100 μL de soro soro para os soro e isológico amortecida pelo fosfato (PBS). Pipeta 5-10 μL de células resuspensas e local em um slide de vidro. Espalhe em um círculo maior e deixe secar.Nota: Se as células não forem aderentes, use slides revestidos de poli-l-lisina. Circule o ponto celular com caneta PAP e cubra com 50 μL de 2,5% de paraformaldeído (PFA) na PBS. Incubar em RT por 10 min.CUIDADO: Pfa é inflamável e pode causar problemas de saúde se inalado ou em contato com a pele. Os itens contaminados com PFA devem ser descartados como resíduos perigosos. Lave 3x com PBS. Toque líquido fora na toalha de papel e cubra com 100 μL de PBS. Repita duas vezes. Descarte a lavagem final. Prepare slides para armazenamento de vários dias. Se realizar PEIXE no mesmo dia, prossiga para a etapa 3.9 sem as etapas nesta seção.NOTA: É preferível realizar a hibridação imediatamente, mas se curto no tempo siga o passo 3.8 antes de armazenar. Os slides podem ser armazenados por vários dias a 4 °C. Cubra o local com 60% de etanol. Incubar na RT por 3 min. Descarte a solução. Cubra o local com 80% de etanol. Incubar na RT por 3 min. Descarte a solução. Cubra o local com 100% de etanol. Incubar na RT por 3 min. Descarte a solução. Vá para o passo 3.9. Coloque os slides descobertos em um forno de hibridização a 50 °C por 1 h. Se o passo 3.8 foi seguido, armazenar os slides em 4 °C. Se não, proceder ao passo 4.2 para executar o protocolo de hibridização. 4. Peixe sstaining em tecidos do intervalo do GI Seções histológicas incorporadas à parafina de cera. Em um forno de hibridização, prewarm um frasco Coplin preenchido com xileno a 60 °C. Insira os slides no frasco cheio de xileno. Coloque a 60 °C por 10 min. Descarte a lavagem de xileno. Mantenha os slides no frasco e despeje o xileno em um recipiente de resíduos. Despeje xileno RT fresco no frasco e incubar a 60 °C por 10 min. Descarte a segunda lavagem de xileno. Encha o frasco com 100% de etanol e incubar em RT por 5 min. Retire os slides do frasco e ar seco. Defina o forno de hibridização para 50 °C para etapas na seção 4.2. Mancha C. albicans com a ponta de prova dos PEIXES. Prepare 1 mL de solução de hibridização fresca (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.1% sulfato dodcyl de sódio [SDS], 1% formamide em água livre de RNase). Veja a Tabela 1 para cálculos de amostras. Misture 50 μL de solução de hibridização com 1 μL de sonda C. albicans (5′ Cy3- ACAGCAGAAGCCGTGCC 3′; 50 μg/mL em água livre de RNase) para uma quantidade final de sonda de 0,5 μg por slide.Nota: Muitos ratos de raça laboratorial não contêm fungos entre suas microbiotas. Neste caso, é possível substituir uma sonda panfúngica (5′ Cy3-CTCTCTCTCTTCACCCTATTC 3′) que reconhece 23S rRNA da maioria das espécies fúngicas, não apenas c. albicans. Na experiência dos autores, a sonda panfúngica produz uma coloração mais brilhante do que a sonda c. albicans-específica. Proteger a solução da luz e pré-morno a 50 °C. Usando uma caneta PAP, desenhar um círculo em torno da seção de tecido da seção 4.1. Pipete 50 μL de solução de hibridização contendo sonda para o tecido fixo e espalhou suavemente sobre a seção de tecido com uma ponta de pipeta. Sobreponha o líquido com um coverslip de hibridização certificando-se de evitar bolhas. Selar slides em uma câmara de hibridização à prova d’água e incubar as seções para 3 h a 50 °C no escuro em um forno de hibridização. Enquanto isso, prepare 50 mL de solução de lavagem de PEIXE (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.9 M NaCl em água livre de RNase). Veja a Tabela 1 para cálculos de amostras. Mova a solução de lavagem para 50 °C para pré-aquecer. Após 3 h, adicione a solução de lavagem a um frasco de Coplin. Em seguida, retire cuidadosamente o coverslip do slide com fórceps e coloque o slide na solução de lavagem. Cubra o frasco com papel alumínio e incubada a 50 °C por 20 min. Durante esta incubação, prepare a solução de coloração mucin-nuclei (20 ng/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI], 1,6 μg/mL fluorescein isothiociaanate [FITC]-lectina na PBS). Veja a Tabela 1 para cálculos de amostras. Para o estômago e intestinogrosso, use FITC-Ulex europaeus agglutinina 1 (UEA-1). Para intestinos delgados e cécum, use uma combinação de FITC-UEA-1 e FITC-trigo germinina (WGA).Nota: Lectinas de diferentes espécies reconhecem diferentes modificações de açúcar de glicoproteínas, como a mucina. As combinações de lectina recomendadas aqui foram determinadas empiricamente para coloração ideal de muco em diferentes compartimentos gi. Lave os slides derramando fora da solução de lavagem peixe e reencher o frasco com RT PBS. Despeje fora do PBS imediatamente e reabastecer com PBS. Despeje fora do PBS para um total de 2 laves. Wick afastado o PBS com um tecido delicado limpador de tarefas e circunda a seção de tecido intestinal com uma caneta PAP. Coloque os slides em um recipiente de plástico opaco e adicione 50 μL de mucin-nuclei solução de coloração para a seção de tecido. Cubra o recipiente com papel alumínio para proteger da luz. Incubar a 4 °C por 45 min. Coloque os slides em um frasco Coplin e lave rapidamente duas vezes na PBS em RT. Toque afastado o PBS adicional em uma toalha de papel, e pavio então afastado as gotas finais de PBS com um tecido. Coloque uma gota de montagem média em cada seção e sobreposição com um coverslip de vidro, evitando bolhas. Deixe o meio de montagem espalhar todo o deslizamento de cobertura. Para imagens imediatas, ancorar o coverslip no lugar com esmalte nos cantos. Para armazenamento a longo prazo, selar em torno do coverslip com esmalte. Imagem dos slides usando um microscópio fluorescente.