上皮内蛍光を用いたマウス消化管におけるカンダアルビカンスの可視化

以下に説明する手順は、UCSF機関動物管理利用委員会(IACUC)によって承認されています。 1. 口腔ガビ細胞を用いたC.アルビカンスによるマウスの消化管コロニー形成 地元のIACUCの承認を受けて、18-21gの雄または雌のマウス(8-10週齢)にハウジングを提供します。初日からオートクレーブフードと水を使用してください。注:殺菌ケージ、寝具、食品、水を使用すると、腸からC.アルビカンを置き換える可能性のある抗生物質耐性環境細菌による汚染のリスクを低減します。また、実験の質問に応じて、マウスはコプロファジーであり、腸の内容物はコハウス動物間で共有されるため、動物の個々のハウジングを考慮する必要があります。 翌日、オートクレーブ飲料水を5%グルコース、1,500 U/mLペニシリンG、および2mg/mLストレプトマイシンを含むオートクレーブ水に交換してください。 便宜上、200x抗生物質ストック溶液(表1)をあらかじめ調製し、殺菌を濾過し、-20°Cで凍結する。 抗生物質で動物を1週間維持する。 抗生物質が開始された後の3日と6日に、抗生物質耐性好気性細菌による汚染について各動物の便を評価する。片手で動物を保持し、アヌスの近くに上限のないマイクロフュージチューブを置き、少なくとも1つの便ペレットを収集します。 各フェカルペレットをルリアスープ(LB)、酵母エキスペプトンデキストロース(YEPD)、または脳心臓注入(BHI)と血液寒天プレートの1mLの滅菌水とプレート100°Lで再サスペンドします。37°Cで標準インキュベーター(嫌気性ではない)でプレートを一晩インキュベートし、細菌の増殖を評価します。注:プレートは、最小限の成長(0-20コロニー)を示す必要があります。ペニシリンとストレプトマイシンで治療した動物から>20コロニーの細菌が回収された場合、C.アルビカンスによる高レベルのコロニー形成が確立され、実験を中止する可能性は低い。 ガベージの3日前に、凍結グリセロール株からYEPD+2%寒天プレートにC.アルビカンスをストリークし、2日間30°Cでインキュベートする。 ギャバゲージの1日前に、各C.アルビカンス株の1つのコロニーを接種し、液体YEPDの5 mLに試験する。振とうで一晩30°Cでインキュベートする。 ギャヴァージュの朝、C.アルビカンスの飽和培養物を、YEPDを30°Cに前温したYEPDの100mL中0.1の600nm(OD600)の光学密度に希釈する。OD 600が1(中間対対数成長)に達するまで、4時間から5時間の間、30°Cで200 rpmで軌道シェーカーで振ります。 各100 mL培養物を2本の50mL円錐管に移し、室温(RT)で5分間3,000 x gで遠心分離機を送ります。注: C. アルビカンスはRT で比較的ゆっくりと伝播します。このプロトコルを別の種に適応させる場合、イノクラは継続的な成長を防ぐために氷の上に保つ必要があるかもしれません。 上清を廃棄し、培養50mL当たり20mLの滅菌生理食塩分でペレット化細胞を再懸濁し、重複した再懸濁ペレットを単一の円錐管にプールする。5分間3,000 x gで遠心分離機。 上清を捨て、滅菌生理食塩分20mLで再サスペンドする。渦を短時間で取り外し、OD600測定用に20°Lを除去します。滅菌正常生理食塩水で1:50を希釈する。残りの再懸濁細胞を3,000 x gで5分間遠心分離する。 上清を捨てる。1 x 108 CFUの接種サイズの場合、OD600測定から決定された推定濃度に基づいて、ペレット化された細胞を約5 x 108 CfUs/mLに無菌正常生理食塩水中に再スレドします。注:典型的には、1のOD600は、〜1x 107酵母細胞/mLに相当する。この値は分光光度計によって異なる場合があり、確認する必要があります。異なる微生物との感染に対して濃度の変化が望ましい場合は、動物への不快感を最小限に抑えるために、≤10 μL/gマウスの接種体積を計画します。 1:1,000希釈をヘモサイトメーターでカウントして、接種の濃度を確認します。ヘモサイトメーターを使用して決定された濃度に基づいて、ゲーブされる細胞の体積を調整します。 動物の摂食針(図1A)を使用して、所定の接種物の計算された体積で各動物をギャバゲージする。ゲーバ手順については、手順 1.13.1-1.13.8 を参照してください。注:ギャバゲージのトレーニングは、経験豊富な開業医から取得する必要があり、手順は事前に習得する必要があります。単一の動物の正常な手順は、通常1分以上かかります。 オートクレーブされた動物飼育針を1mLの注射器に取り付け、注射器を1つのガベの容積で満たし、不正確な線量を避けるために気泡を除去する。滅菌面に置きます。 動物を飼育してください。支配的な手で尾の底に動物を保持し、耳のすぐ後ろの緩い皮膚に動物の背中に動物の背中をスライドさせます。 利き手の人差し指と親指を使用して、緩い皮膚をしっかりと一緒に集めます。これが「スクラップ」です。その擦り傷によって動物をピックアップし、手のひらに対して動物を固定するために尾の周りに同じ(非支配的な)手の小さな指をループ。動物の頭と体(したがって首と食道)が直線になるように、動物の頭をそっと伸ばします。注:動物の体が曲がったりねじれたりしている間に気道を試みると、食道穿話や動物の死などの合併症を引き起こす可能性がある。 利き手で注射器を拾い上げ、曲がった針を下に向けて動物に垂直に保持します(図1B)。針のボールを使って、口の内側の隅をそっと引っ掛け、口の側面に沿ってそっと喉の後ろに針を進め、最後に針を中央に動かします。注:横道に沿って針を導入することは、動物の歯や舌からの抵抗を避けるのに役立ちます。 針のボールが喉の後ろに回ったら、動物の体幹線と平行になるように針を上に傾けます(図1C)。注:この時点で、動物はギャグ反射を示します。これは、針が正しく配置されていることを示す良い兆候であり、ギャギングモーションは、食道の下に針を導くのに役立ちます。ギャグ反射がなければ、針は食道ではなく気管にある。針をそっと引き出し、ステップ1.13.1に戻します。 動物が数ミリメートルしか見えないまで接種を飲み込むことを許可する(図1D)。針を滑らかに進めます。注:針が進まない場合は、食道に損傷を与える可能性のある力の使用を避けてください。時には最後の半分センチメートルを進めるには、動物からの特大のギャグが必要になります。針が詰まっているように見える場合は、ゆっくりと取り出し、ステップ1.13.4からやり直してください。 針のボールが適切な位置(胃)にあるかどうかをテストします。抵抗がない場合は、接種を続けます。接種が行われたら、ゆっくりと針を引き出す。 ケージ内の動物を交換し、5-10分間動物を監視し続け、骨の折れた呼吸や苦痛の兆候がないか。動物がギャージュの直後に正常な活動を再開することを確認します。 同じ接種が次の動物と一緒に使用される場合は、アルコールワイプで針をきれいにします。ステップ 1.13.1 に戻る。別の接種を使用する場合は、新しい針を使用して、手順 1.13.1 に戻ります。注:動物をガヴェージの翌日に検査することが重要です。苦痛の徴候を示す動物(例えば、ハンチンした姿勢、骨の折れた呼吸)は、食道破裂、肺への損傷、または回復が起こりにくい別の内部傷害を受けた可能性が高いので、人道的に安楽死させるべきである。 動物のガベジに続いて、用量検証のためのイノクラのプレート希釈。 1:105までの10倍のシリアル希釈を準備します。1:105希釈の1つのガベジ体積を、サブラウドデキストロース寒天の100mmプレートにプレートします。 プレートを30°Cで2日間インキュベートします。接種量を確認するためにCFOをカウントします。 2. 組織学のための消化管組織の準備 注:プロトコルのこのセクションは、ヨハンソンとハンソン16から適応されています。 500mLのメタカーン溶液(60%メタノール、30%クロロホルム、10%氷酢酸)を、解剖した2匹につき大きなスクリューキャッププラスチック瓶に入れて調製します。注意:メタノールとクロロホルムは吸入すると有害であり、化学フードで操作する必要があります。氷酢酸は腐食性であり、適切な個人的な保護具で扱われるべきである。メタノール、クロロホルム、氷酢酸は有害廃棄物として廃棄する必要があります。 実験エンドポイントでは、局所IACUCによって承認されたプロトコルに従って動物を人道的に安楽死させる。注:抗生物質処理動物では、C.アルビカンスのコロニー形成は、通常、5日目の~106 CFO/gから25日目までに~5 x 107 CfUs/gまでさまたえる。 10%の漂白剤で解剖ツールを殺菌し、70%エタノールですすします。 各動物を解剖面に固定し、腹側を上に向けます。30 G 針を使用して、四肢を解剖面に固定します(図 2A)。70%のエタノールで動物をスプレーして毛皮をきれいにし、工具への付着を最小限に抑えます。 鈍い力を使用して、非利き手で腹部の皮膚のセクションをつまみます。利き手でハサミを使用して、骨盤の基部の近くに皮膚と下層筋膜を切開します。腹腔の両側に沿ってU字形で切開部を延長し、肋骨ケージまで伸ばします。皮膚を邪魔にします。 鉛筆を使用して、評価する GI セグメントのヒストロジーカセットのラベルをあらかじめ付けます。たとえば、動物ごとに、カセットを「胃」、「近位小腸」、「中小腸」、「遠位小腸」、「セカム」、「大腸」と別々にラベルを付けます。各カセットの底部にフォームパッドを置きます(図2A)。メモ:図2Bは、カセットに配置する推奨セクションの概要を示しています。 鈍い終わりの鉗子を使用して、腹腔から直腸を穏やかに抽出する。はさみを使用して、卵丘と小腸と大腸の間の接続を切断します。注:セカル組織は非常に繊細で破裂しやすいです。操作するときは注意してください。 セカム全体を組織学のカセットに入れて、ねじれないようにして平らに置きます(図2C)。上に2つ目の泡パッドを置き、カセットを閉じます。カセットをメタカーンを入れたスクリューキャップの瓶に入れます。 カセットよりも長さが短い1-2の便ペレットを含む大腸の一部を切除する。 組織セクションをカセットに入れ、組織を平らにしてねじれたく留め合います。2番目の泡パッドでオーバーレイし、カセットを閉じます。カセットをメタカーンに入れます。 サンプリングする小腸の各セクションについて、消化器を含む 1~2 cmのセグメントを切除します。 組織を平らにしてねじれのない状態に保ち、組織学のカセットにセグメントを配置します。2番目の泡パッドでオーバーレイし、カセットを閉じます。カセットをメタカーンに入れます。 胃の場合は、食道と小腸への接続を切断します。カセットに入れ、ティッシュを平らにしてねじれな状態に保ちます。2番目の泡パッドでオーバーレイし、カセットを閉じます。カセットをメタカーンに入れます。 カセットをメタカーン溶液に入れたままにして、少なくとも3時間2週間はRTに入れます。注:固定 GI セグメントを商用ヒストロジー サービスに転送できるポイントはいくつかあります。これらの組織は、発光内容物の破壊なしに切除することが困難であり、経験豊富な技術者によって最適な結果が得られます。商業サービスがパラフィンに組織を埋め込む前にワッシュを行う意思がある場合、カセットはステップ2.16の指示と共にこの段階で送信することができる。 予熱70°ハイブリダイゼーションオーブンで大きなビーカーですべてのティッシュカセットをカバーするのに十分なパラフィンワックスを溶かし始めます。 固定後、フォームパッドを取り外し、各無傷の組織セクションをカセットに戻します。RTで次の溶液でティッシュを振とうで洗う:100%メタノールで35分に2回、100%エタノールで25分間2回、キシレンで20分間2回。注意:キシレンは可燃性で有毒であり、吸入すると損傷を引き起こすことがある。適切な保護と化学フードで使用します。有害廃棄物の手順を介してキシレンを処分します。 カセットをペーパータオルで乾かし、ハイブリダイゼーションオーブンで70°Cで2時間、予め溶かしたパラフィンワックスに入れます。カセットがパラフィンで満たされ、気泡が残らないようにします。注:このステップはワックスがGIセグメントに浸透し、組織および内容物を安定させることを可能にする。 ワックスからカセットを取り出し、余分なワックスを排出させ、ワックスブロックに埋め込まれるまでRTに保管します。微量のキシレンを含むワックスを有害廃棄物として捨てます。注:ノーブルラボは、組織の埋め込みと断面化のための商業組織学サービスを使用しています。C.アルビカン酵母およびヒファエの標準的な可視化のために、4μmセクションが使用される。通常は複数の平面を通るハイファルセグメントの接続性を評価するために、8μmの断面を使用できます。FISHプローブが検体に浸透する能力によっては、さらに厚い切片を使用することができる場合があります。 3. 新設計プローブの検証 注:C. アルビカンスプローブを検証するための以下のプロトコルは、スウィジンスキーら17から適合した。 ストリークC.アルビカンスSC5314および密接に関連するコンパレータ種(例えば、カンジダ・ダブリン症、カンジダ・トロカリシス)にYEPD+2%寒天プレート。30 °Cで1−2日間インキュベートする。 単一コロニーで液体YEPD培地の5mLを接種する。 懸濁した細胞のピペット1mLをマイクロ遠心管に、遠心分離機を3,000xgで5分間廃棄する。 リン酸緩衝生理食塩分(PBS)のペレットを100μLで再スペンドします。 ピペット5−10 μLの再懸濁された細胞およびガラススライドの上にスポット。より大きな円に広げ、乾燥させます。注:細胞が付着していない場合は、ポリ-L-リジンコーティングスライドを使用してください。 細胞スポットをPAPペンで円で囲み、PBSで2.5%パラホルムアルデヒド(PFA)の50°Lで覆います。RTで10分間インキュベートします。注意:PFAは可燃性であり、吸入されたり皮膚に接触したりすると健康上の問題を引き起こす可能性があります。PFAで汚染された物品は、有害廃棄物として廃棄する必要があります。 PBSで3xを洗います。ペーパータオルに液体をタップし、PBSの100°Lで覆います。2 回繰り返します。最終洗浄を破棄します。 複数日のストレージ用にスライドを準備します。同じ日に FISH を実行する場合は、このセクションの手順を実行せずに手順 3.9 に進みます。注:ハイブリダイゼーションをすぐに実行することをお勧めしますが、時間が短い場合は、保存する前にステップ3.8に従ってください。スライドは4 °Cで数日間保存することができます。 60%のエタノールでスポットをカバーします。RTで3分間インキュベートします。 80%のエタノールでスポットをカバーします。RTで3分間インキュベートします。 100%エタノールでスポットをカバーします。RTで3分間インキュベートします。ステップ 3.9 に進みます。 ハイブリダイゼーションオーブンで1時間50°Cでスライドを外します。手順3.8に従った場合は、スライドを4°Cに保管してください。そうでない場合は、ステップ 4.2 に進み、ハイブリダイゼーション プロトコルを実行します。 4. GIトラクト組織における魚のスステイン デワックスパラフィン埋め込み組織学的セクション。 ハイブリダイゼーションオーブンで、キシレンで満たされたコプリン瓶を60°Cに前温します。 キシレン入り瓶にスライドを挿入します。60°Cで10分間置き、キシレン洗浄を廃棄します。スライドを瓶に入れ、キシレンを廃棄物容器に注ぎます。 新鮮なRTキシレンを瓶に注ぎ、60°Cで10分間インキュベートします。 瓶に100%エタノールを充填し、RTで5分間インキュベートします。 セクション4.2のステップでハイブリダイゼーションオーブンを50°Cに設定します。 FISHプローブでC.アルビカンを染色します。 新鮮なハイブリダイゼーション溶液(20 mM Tris–HCl、pH 7.4、0.9 M NaCl、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、RNaseフリーウォーター中の1%ホルムアミド)を調製します。サンプル計算については、表 1を参照してください。 50 μLのハイブリダイゼーション溶液を1μLのC.アルビカンスプローブ(5’Cy3-ACAGCAGAAGCCGTCC 3′;RNaseフリー水で50μg/mL)と混ぜ合わせ、スライドあたり0.5μgの最終プローブ量を得ます。注:多くの実験室育ちのマウスは、微生物叢の中に真菌を含んでいない。この場合、C.アルビカンスだけでなく、ほとんどの真菌種の23S rRNAを認識するパン真菌プローブ(5’CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtTATTC 3′)を置換することができる。著者の経験では、パン真菌プローブは、C.アルビカンス特異的プローブよりも明るい染色を生み出す。 溶液を光から保護し、50°Cに前暖にします。 PAPペンを使用して、セクション4.1から組織セクションの周りに円を描きます。 ピペット50μLのプローブ含有ハイブリダイゼーション溶液を固定組織上に、ピペットチップで組織部に穏やかに広げた。気泡を防ぐようにハイブリダイゼーションカバースリップで液体をオーバーレイします。 密封は、水密ハイブリダイゼーションチャンバーでスライドし、ハイブリダイゼーションオーブンで暗闇の中で50°Cで3時間のセクションをインキュベートします。 一方、FISH洗浄液50mL(20mMトリスHCl、pH 7.4、0.9 M NaCl、RNaseフリー水)を調製します。サンプル計算については、表 1を参照してください。 洗浄液を50°Cに動かして前温を下ろします。 3時間後、コプリン瓶に洗浄液を加える。次に、鉗子でスライドからカバースリップを慎重に取り外し、スライドを洗浄液に入れます。 瓶をアルミホイルで覆い、50°Cで20分間インキュベートします。 このインキュベーション中に、ムチン核染色溶液(20ng/mL 4′,6-ジアミディノ-2-フェニリンドール[DAPI]、1.6μg/mLフルオレセインイソチオシアネート[FITC]レクチン)を調製する。サンプル計算については、表 1を参照してください。胃および大腸の場合は、FITC-ウレックスエウロパエウス凝集1(UEA-1)を使用してください。小腸と精液の場合は、FITC-UEA-1 と FITC-小麦胚芽凝集体 (WGA) を組み合わせて使用します。注:異なる種のレクチンは、ムチンなどの糖タンパク質の異なる糖修飾を認識します。ここで推奨されるレクチンの組み合わせは、異なるGIコンパートメントにおける粘液の最適な染色のために経験的に決定された。 FISH洗浄液を注ぎ、瓶にRT PBSを詰め込んでスライドを洗います。すぐにPBSを注ぎ、PBSで補充します。合計2つのワッシュのためにPBSを注ぎます。 繊細なタスクワイパーティッシュでPBSを取り除き、PAPペンで腸組織セクションを円で囲みます。スライドを不透明なプラスチック容器に入れ、50μLのムチン核染色液を組織部に加えます。光から保護するためにアルミ箔で容器を覆います。4°Cで45分間インキュベートする。 コプリン瓶にスライドを置き、RTでPBSで素早く2回洗います。 ペーパータオルで余分なPBSをタップし、組織でPBSの最終的な滴を拭き取ります。 各セクションに取り付け媒体の1滴を置き、ガラスカバースリップでオーバーレイし、気泡を防ぎます。取り付け媒体をカバースリップ全体の下に広げます。即時イメージングのために、カバースリップをコーナーにマニキュアで固定します。長期保存の場合は、カバースリップの周りにマニキュアでシールします。 蛍光顕微鏡を用いてスライドを画像化します。