Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Die nachstehend beschriebenen Schritte wurden vom UCSF Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. 1. Gastrointestinale Kolonisation von Mäusen mit C. albicans mit Oral Gavage Bereitstellung von Wohnraum für 18-21 g männliche oder weibliche Mäuse (8 bis 10 Wochen alt), wie von der lokalen IACUC genehmigt. Verwenden Sie autoklavierte Nahrung und Wasser ab dem ersten Tag.HINWEIS: Die Verwendung von sterilisierten Käfigen, Bettwäsche, Lebensmitteln und Wasser reduziert das Risiko einer Kontamination mit antibiotikaresistenten Umweltbakterien, die C. Albicans potenziell aus dem Darm verdrängen können. Darüber hinaus sollte je nach Versuchsfrage die individuelle Unterbringung von Tieren in Betracht gezogen werden, da Mäuse koprophage sind und Darminhalte unter den Tieren geteilt werden. Ersetzen Sie am nächsten Tag das autoklavierte Trinkwasser durch autoklaviertes Wasser, das 5 % Glukose, 1.500 U/ml Penicillin G und 2 mg/ml Streptomycin enthält. Bereiten Sie im Voraus 200x Antibiotika-Lagerlösungen (Tabelle 1) vor, filtern Sie sie und frieren Sie bei -20 °C ein. Halten Sie Tiere auf Antibiotika für eine Woche. Bewerten Sie an den Tagen 3 und 6 nach dem Start von Antibiotika den Kot jedes Tieres auf Kontamination mit antibiotikaresistenten aeroben Bakterien. Halten Sie ein Tier mit einer Hand, legen Sie ein ungekapseltes Mikrofugerohr in die Nähe des Anus und sammeln Sie mindestens ein Fäkalienpellet. Setzen Sie jedes Fäkalpellet in 1 ml sterilem Wasser und Platte 100 l auf Luria-Brühe (LB), Hefeextrakt Pepton-Dextrose (YEPD) oder Hirnherzinfusion (BHI) plus Blut-Agar-Platten. Inkubieren Sie die Platten über Nacht in einem Standard-Inkubator (nicht anaerobe) bei 37 °C und bewerten Sie das Bakterienwachstum.HINWEIS: Die Platten sollten ein minimales Wachstum aufweisen (0 bis 20 Kolonien). Wenn >20 Kolonien von Bakterien von Tieren mit Penicillin und Streptomycin behandelt werden, dann ist es unwahrscheinlich, dass high-level Besiedlung mit C. albicans etabliert werden und das Experiment abgebrochen werden sollte. Drei Tage vor dem Gavage Streifen C. albicans von gefrorenen Glycerinvorräten zu YEPD + 2% Agarplatten und inkubieren bei 30 °C für 2 Tage. Einen Tag vor der Gavage impfen Sie eine Kolonie jedes C. albicans-Stamms, der in 5 ml flüssiges YEPD getestet werden soll. Bei 30 °C über Nacht mit Schütteln bebrüten. Am Morgen der Gavage, verdünnen Sie die gesättigte Kultur von C. albicans auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,1 in 100 ml YEPD auf 30 °C vorgewärmt. Schütteln Sie in einem Orbital-Shaker bei 200 Rpm bei 30 °C zwischen 4 h und 5 h, bis OD600 1 erreicht (Mitte-Log-Wachstum). Jede 100 ml Kultur auf zwei 50 ml konische Rohre und Zentrifuge bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) übertragen.HINWEIS: C. albicans propagiert sich relativ langsam bei RT. Wenn dieses Protokoll für eine andere Art angepasst wird, muss die Impfung möglicherweise auf Eis gehalten werden, um ein anhaltendes Wachstum zu verhindern. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die pelletierten Zellen in 20 ml steriler Saline pro 50 ml Kultur wieder auf und bündeln Sie die doppelten resuspendierten Pellets in einzelne konische Rohre. Zentrifuge bei 3.000 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 20 ml steriler Saline wieder auf. Wirbel kurz und entfernen Sie 20 l für OD600 Messung. 1:50 in steriler normaler Saline verdünnen. Zentrifugieren Sie die verbleibenden resuspendierten Zellen bei 3.000 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand. Bei einer Inokulumgröße von 1 x 108 KBE setzen Sie die pelletierten Zellen auf ca. 5 x 108 KBE/ml in steriler normaler Salin auf der Grundlage der geschätzten Konzentration aus der OD600-Messung aus.HINWEIS: In der Regel entspricht ein OD600 von 1 1 1 x 107 Hefezellen/ml. Dieser Wert kann je nach Spektralphotometer variieren und sollte überprüft werden. Wenn eine Änderung der Konzentration für Infektionen mit einem anderen Mikroorganismus gewünscht wird, planen Sie ein Inokulumvolumen von 10 L/g Maus, um Beschwerden für das Tier zu minimieren. Überprüfen Sie die Konzentration des Inokulums, indem Sie eine Verdünnung von 1:1.000 mit einem Hämozytometer zählen. Passen Sie das Volumen der zellen, die mit Hilfe des Hämozytometers bestimmt werden, auf der Grundlage der mit dem Hämozytometer ermittelten Konzentration. Mit einer Fütterungsnadel(Abbildung 1A) wird jedes Tier mit dem berechneten Volumen eines gegebenen Inokulums gegavtieren. Siehe Schritte 1.13.1-1.13.8 für das Gavage-Verfahren.HINWEIS: Die Ausbildung für Gavage sollte von einem erfahrenen Praktiker erhalten werden, und das Verfahren sollte im Voraus gemeistert werden. Ein erfolgreiches Verfahren für ein einzelnes Tier dauert in der Regel nicht länger als 1 min. Befestigen Sie eine autoklavierte Tierfütterungsnadel an einer 1 ml Spritze und füllen Sie die Spritze mit einem Gavage-Volumen, wodurch Luftblasen entfernt werden, um eine ungenaue Dosis zu vermeiden. Auf eine sterile Oberfläche legen. Sichern Sie das Tier für gavage. Halten Sie das Tier mit der dominanten Hand an der Basis des Schwanzes und gleiten Sie die nicht dominante Hand auf den Rücken des Tieres zur lockeren Haut direkt hinter den Ohren. Mit dem Zeigefinger und Daumen der nicht dominanten Hand, sammeln Sie die lose Haut fest zusammen; dies ist die “Scruff”. Nehmen Sie das Tier durch seine Schuppundung und Schleife kleinen Finger der gleichen (nicht dominanten) Hand um den Schwanz, um Das Tier gegen die Handfläche zu immobilisieren. Dehnen Sie den Kopf des Tieres sanft aus, so dass Kopf und Körper (und damit Hals und Speiseröhre) in einer geraden Linie sind.HINWEIS: Der Versuch einer Gavage, während der Körper des Tieres gebogen oder verdreht ist, kann zu Komplikationen wie Ösophagenerationsperforation und Tod des Tieres führen. Nehmen Sie die Spritze mit der dominanten Hand und halten Sie senkrecht zum Tier, mit der gekrümmten Nadel nach unten zeigen(Abbildung 1B). Mit der Kugel der Nadel, sanft eine innen Ecke des Mundes, sanft die Nadel entlang der Seite des Mundes auf die Rückseite des Halses zu bewegen, und schließlich bewegen Sie die Nadel in die Mitte.HINWEIS: Die Einführung der Nadel auf einem seitlichen Weg hilft, Resistenzen von den Zähnen und der Zunge des Tieres zu vermeiden. Sobald sich die Kugel der Nadel an der Rückseite des Rachens befindet, kippen Sie die Nadel nach oben, so dass sie parallel zur Körperlinie des Tieres ist (Abbildung 1C).HINWEIS: An dieser Stelle zeigt das Tier einen Knebelreflex. Dies ist ein gutes Zeichen, das darauf hinweist, dass die Nadel richtig positioniert ist, und die Knebelbewegung hilft, die Nadel die Speiseröhre hinunter zu führen. Wenn es keinen Knebelreflex gibt, kann sich die Nadel eher in der Luftröhre als in der Speiseröhre befinden. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück und fahren Sie mit Schritt 1.13.1 fort. Lassen Sie das Tier das Inokulum schlucken, bis nur wenige Millimeter sichtbar bleiben (Abbildung 1D). Fördern Sie die Nadel sanft.HINWEIS: Wenn die Nadel nicht vorrückt, vermeiden Sie die Anwendung von Gewalt, die die Speiseröhre beschädigen kann. Manchmal erfordert das Vorrücken des letzten halben Zentimeters einen extra großen Gag des Tieres. Wenn die Nadel festzustecken scheint, ziehen Sie sie langsam zurück und versuchen Sie es erneut von Schritt 1.13.4. Testen Sie, ob sich die Nadelkugel an der richtigen Position (Magen) befindet, indem Sie den Kolben sanft voranbringen. Wenn es keinen Widerstand gibt, setzen Sie die Lieferung des Inokulums fort. Sobald das Inokulum verabreicht wurde, ziehen Sie die Nadel langsam zurück. Ersetzen Sie das Tier in seinem Käfig und überwachen Sie das Tier weiterhin für 5 bis 10 min auf Anzeichen von mühsamer Atmung oder Not. Vergewissern Sie sich, dass das Tier kurz nach der Vermehrung wieder normal tätig wird. Wenn das gleiche Inoculum mit dem nächsten Tier verwendet wird, reinigen Sie die Nadel mit einem Alkoholtücher. Fahren Sie mit Schritt 1.13.1 fort. Wenn ein anderes Inokulum verwendet wird, verwenden Sie eine neue Nadel und fahren Sie mit Schritt 1.13.1 fort.HINWEIS: Es ist wichtig, die Tiere am Tag nach der Vermehrung zu inspizieren. Tiere, die Anzeichen von Bedrängnis aufweisen (z. B. geknickte Körperhaltung, mühsame Atmung), sollten menschlich eingeschläfert werden, da sie wahrscheinlich einen Ösopharienbruch, eine Schädigung der Lunge oder eine andere innere Verletzung erlitten haben, von der eine Genesung unwahrscheinlich ist. Nach der Verdünnung der Tiere werden die Ozinluden des Inokulas zur Dosisüberprüfung verdünnt. Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen bis 1:105vor. Platte ein GavageVolumen der 1:105 Verdünnung auf eine 100 mm Platte von Sabouraud dextrose Agar. Inkubieren Sie die Platte für 2 Tage bei 30 °C. Zählen Sie KBE, um die Inokulumdosis zu bestätigen. 2. Herstellung von Magen-Darm-Geweben für die Histologie HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls ist von Johansson und Hansson16adaptiert. Bereiten Sie 500 ml Methacarnlösung (60% Methanol, 30% Chloroform, 10% Eisessig) in einem großen Schraubverschluss-Kunststoffglas für je 2 sezierte Tiere vor.ACHTUNG: Methanol und Chloroform sind beim Einatmen schädlich und sollten in einer chemischen Haube manipuliert werden. Eisessigsäure kann ätzend sein und sollte mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung behandelt werden. Methanol, Chloroform und Eisessig sollten als gefährliche Abfälle entsorgt werden. Am experimentellen Endpunkt, euthanisieren Tiere human nach einem Protokoll von der lokalen IACUC genehmigt.HINWEIS: Bei mit Antibiotika behandelten Tieren reicht die Besiedlung von C. albicans in der Regel von 106 KBE/g an Tag 5 bis zu 5 x 107 KBE/g pro Tag 25. Sterilisieren Sie Sezierwerkzeuge mit 10% Bleichmittel und spülen Sie mit 70% Ethanol. Befestigen Sie jedes Tier an einer Sezierfläche, wobei die ventrale Seite nach oben gerichtet ist. Verwenden Sie 30 G Nadeln, um die Gliedmaßen an der Sezierfläche zu befestizieren (Abbildung 2A). Sprühen Sie das Tier mit 70% Ethanol, um das Fell zu reinigen und das Kleben an den Werkzeugen zu minimieren. Mit stumpfen Zangen, kneifen Sie einen Abschnitt der Bauchhaut mit nicht dominanter Hand. Mit einer Schere mit dominanter Hand, Incise die Haut und die darunter liegende Faszien in der Nähe der Basis des Beckens. Erweitern Sie den Schnitt in einer U-Form entlang jeder Seite der Peritonealhöhle bis zum Rippenkäfig. Heben Sie die Haut aus dem Weg. Mit einem Bleistift, voretikettieren Histologie-Kassetten für die GI-Segmente bewertet werden. Zum Beispiel, für jedes Tier, kennzeichnen Sie separate Kassetten als “Magen”, “proximale Dünndarm”, “mittlerer Dünndarm”, “distalen Dünndarm”, “Cecum” und “großer Darm”. Legen Sie ein Schaumstoffpad auf die Unterseite jeder Kassette (Abbildung 2A).ANMERKUNG: Abbildung 2B zeigt die vorgeschlagenen Abschnitte, die in Kassetten platziert werden sollen. Mit stumpfen Zangen, vorsichtig extrahieren Sie das Cecum aus der Peritonealhöhle. Verwenden Sie eine Schere, um Verbindungen zwischen dem Cecum und dem kleinen und großen Darm zu trennen.HINWEIS: Cecal Gewebe ist sehr empfindlich und leicht zu brechen. Achten Sie beim Manipulieren. Legen Sie das gesamte Cecum in eine Histologiekassette, so dass es ungedreht ist und flach liegt (Abbildung 2C). Legen Sie ein zweites Schaumstoffpad oben und schließen Sie die Kassette. Legen Sie die Kassette in ein Schraubverschlussglas mit Methacarn. Verbrauchen Sie einen Abschnitt des Dickdarms, der 1-2 Fäkalienpellets enthält, mit einer Länge, die kleiner als die der Kassette ist. Legen Sie den Gewebeabschnitt in die Kassette und halten Sie das Gewebe flach und ungedreht. Overlay mit einem zweiten Schaumstoffpad und schließen Sie die Kassette. Legen Sie die Kassette in Methacarn. Für jeden Abschnitt des Dünndarms, der beprobt werden soll, wird ein Segment von 1 x 2 cm ausgeschnitten, das etwas Verdauungsmaterial enthält. Legen Sie das Segment in eine Histologiekassette, so dass das Gewebe flach und ungedreht bleibt. Overlay mit einem zweiten Schaumstoffpad und schließen Sie die Kassette. Legen Sie die Kassette in Methacarn. Für den Magen, trennen Sie die Verbindungen zur Speiseröhre und Dünndarm. Legen Sie in eine Kassette, halten Sie das Gewebe flach und ungedreht. Overlay mit einem zweiten Schaumstoffpad und schließen Sie die Kassette. Legen Sie die Kassette in Methacarn. Lassen Sie die Kassetten in Methacarn-Lösung bei RT für mindestens 3 h und weniger als 2 Wochen.HINWEIS: Es gibt mehrere Punkte, in denen die festen GI-Segmente an einen kommerziellen Histologiedienst übertragen werden können. Diese Gewebe können schwierig zu abschnitten sein, ohne Unterbrechung des luminalen Inhalts, und optimale Ergebnisse werden von einem erfahrenen Techniker erhalten. Wenn der kommerzielle Dienst bereit ist, Vorarbeiten vor dem Einbetten des Gewebes in Paraffin durchzuführen, können die Kassetten in dieser Phase zusammen mit Anweisungen für Schritt 2.16 gesendet werden. Beginnen Sie mit dem Schmelzen von genügend Paraffinwachs, um alle Gewebekassetten in einem großen Becher in einem vorgeheizten 70 °C Hybridisierungsofen zu bedecken. Entfernen Sie nach der Fixierung die Schaumstoffpads und geben Sie jeden intakten Gewebeabschnitt wieder in seine Kassette zurück. Waschen Sie das Gewebe mit den folgenden Lösungen bei RT mit Schütteln: zweimal für 35 min in 100% Methanol, zweimal für 25 min in 100% Ethanol, zweimal für 20 min in Xylol.ACHTUNG: Xylol ist entzündlich, giftig und kann beim Einatmen Schäden verursachen. Verwenden Sie in einer chemischen Haube mit ordnungsgemäßem Schutz. Xylol über gefährliche Abfallverfahren entsorgen. Die Kassetten trocken auf ein Papiertuch zerlegen und in vorgeschmolzenem Paraffinwachs für 2 h bei 70 °C in einem Hybridisierungsofen abstellen. Stellen Sie sicher, dass die Kassetten mit Paraffin gefüllt sind und keine Blasen mehr übrig bleiben.HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es dem Wachs, das GI-Segment zu infiltrieren und gewebe und den Inhalt zu stabilisieren. Entfernen Sie die Kassetten aus Wachs, lassen Sie das überschüssige Wachs abtropfen und lagern Sie bei RT, bis sie in Wachsblöcke eingebettet sind. Entsorgen Sie das Wachs, das Spuren von Xylolen enthält, als gefährlichen Abfall.HINWEIS: Das Noble Lab nutzt einen kommerziellen Histologie-Service zum Einbetten und Verschnitt enzierens von Geweben. Für die Standardvisualisierung von C. albicans Hefen und Hyphen werden 4 m Abschnitte verwendet. Zur Bewertung der Konnektivität von Hyphensegmenten, die sich in der Regel über mehrere Ebenen erstrecken, können 8 m Abschnitte verwendet werden. Je nach der Fähigkeit von FISH-Sonden, in die Probe einzudringen, kann es möglich sein, noch dickere Abschnitte zu verwenden. 3. Validierung neu entwickelter Sonden HINWEIS: Das folgende Protokoll zur Validierung von C. albicans Sonden wurde von Swidsinski et al.17adaptiert. Streak C. albicans SC5314 und eng verwandte Vergleichsarten (z.B. Candida dubliniensis, Candida tropicalis) zu YEPD + 2% Agarplatten. 1-2 Tage bei 30 °C inkubieren. Impfen Sie 5 ml flüssiges YEPD-Medium mit einer einzigen Kolonie. Pipette 1 ml der suspendierten Zellen zu einem Mikrozentrifugenrohr und Zentrifuge bei 3.000 x g für 5 min. Überstand entsorgen. Setzen Sie das Pellet in 100 l Phosphat-gepufferter Saline (PBS) wieder auf. Pipette 5 x 10 L von resuspendierten Zellen und Punkt auf einem Glasschlitten. In einen größeren Kreis verteilen und trocknen lassen.HINWEIS: Wenn Zellen nicht haften, verwenden Sie Poly-L-Lysin-beschichtete Dias. Kreisen Sie den Zellfleck mit einem PAP-Stift ein und decken Sie mit 50 l 2,5% Paraformaldehyd (PFA) in PBS ab. Bei RT für 10 min inkubieren.ACHTUNG: PFA ist entzündlich und kann bei Einatmen oder Hautkontakt zu gesundheitlichen Problemen führen. Mit PFA kontaminierte Gegenstände sollten als sonderstoffsgefährdender Abfall entsorgt werden. Waschen Sie 3x mit PBS. Tippen Sie auf Flüssigkeit auf Daspapiertuch und decken Sie sie mit 100 l PBS ab. Wiederholen Sie dies zweimal. Letzte Wäsche entsorgen. Bereiten Sie Folien für den mehrtägigen Speicher vor. Wenn Sie FISH am selben Tag ausführen, fahren Sie mit Schritt 3.9 ohne die Schritte in diesem Abschnitt fort.HINWEIS: Es ist vorzuziehen, die Hybridisierung sofort durchzuführen, aber wenn es zu kurzer Zeit ist, folgen Sie Schritt 3.8 vor der Lagerung. Dias können mehrere Tage bei 4 °C gelagert werden. Bedecken Sie den Spot mit 60% Ethanol. Inkubieren Sie bei RT für 3 min. Entsorgen Sie die Lösung. Bedecken Sie den Spot mit 80% Ethanol. Inkubieren Sie bei RT für 3 min. Entsorgen Sie die Lösung. Bedecken Sie den Spot mit 100% Ethanol. Inkubieren Sie bei RT für 3 min. Entsorgen Sie die Lösung. Fahren Sie mit Schritt 3.9 fort. Legen Sie die diabedeckenden Dias in einem Hybridisierungsofen bei 50 °C für 1 h. Wenn Schritt 3.8 befolgt wurde, lagern Sie die Dias bei 4 °C. Wenn dies nicht der Fall ist, fahren Sie mit Schritt 4.2 fort, um das Hybridisierungsprotokoll auszuführen. 4. FISH Sstaining in GI Tract Gewebe Entwachsung sparobin-eingebettete histologische Abschnitte. In einem Hybridisierungsofen ein mit Xylol auf 60 °C gefülltes Coplin-Glas vorwärmen. Legen Sie die Dias in das mit Xylol gefüllte Glas ein. Bei 60 °C für 10 min. Die Xylolwäsche entsorgen. Bewahren Sie die Dias im Glas auf und gießen Sie das Xylol in einen Abfallbehälter. Frisches RT-Xylol in das Glas geben und bei 60 °C 10 min inkubieren. Die zweite Xylolwäsche entsorgen. Füllen Sie das Glas mit 100% Ethanol und inkubieren bei RT für 5 min. Entfernen Sie die Dias aus dem Glas und Luft trocken. Stellen Sie den Hybridisierungsofen für Schritte in Abschnitt 4.2 auf 50 °C. Stain C. albicans mit der FISH-Sonde. Bereiten Sie 1 ml frische Hybridisierungslösung (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,1% Natriumdodecylsulfat [SDS], 1% Formamid in RNase-freiem Wasser) vor. Siehe Tabelle 1 für Beispielberechnungen. Mischen Sie 50 l Hybridisierungslösung mit 1 l C. albicans Sonde (5′ Cy3- ACAGGAGAAGCCGTGCC 3′; 50 g/ml in RNase-freiem Wasser) für eine Endsonde Menge von 0,5 g pro Schlitten.HINWEIS: Viele im Labor gezüchtete Mäuse enthalten keine Pilze unter ihrer Mikrobiota. In diesem Fall ist es möglich, eine Pan-Pilz-Sonde (5′ Cy3-CTCTCTCTTCACCCTATTC 3′) zu ersetzen, die 23S rRNA der meisten Pilzarten erkennt, nicht nur C. albicans. Nach den Erfahrungen der Autoren liefert die Panmykogalsonde eine hellere Färbung als die C. albicans-spezifischeSonde. Schützen Sie die Lösung vor Licht und Vorwärme bis 50 °C. Zeichnen Sie mit einem PAP-Stift einen Kreis um den Gewebeabschnitt aus Abschnitt 4.1. Pipette 50 l sondenhaltige Hybridisierungslösung auf das feste Gewebe und sanft über den Gewebebereich mit einer Pipettenspitze verteilen. Überlagern Sie die Flüssigkeit mit einem Hybridisierungs-Abdeckungsslip, der dafür sorgt, Dassblasen zu vermeiden sind. Versiegeln Sie in einer wasserdichten Hybridisierungskammer und inkubieren Sie die Abschnitte für 3 h bei 50 °C im Dunkeln in einem Hybridisierungsofen. In der Zwischenzeit 50 ml FISH-Waschlösung (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl in RNase-freiem Wasser) vorbereiten. Siehe Tabelle 1 für Beispielberechnungen. Die Waschlösung auf 50 °C in den Vorwarm bewegen. Nach 3 h die Waschlösung in ein Coplin-Glas geben. Entfernen Sie dann vorsichtig den Deckelrutsch mit Zangen von der Rutsche und legen Sie die Rutsche in die Waschlösung. Das Glas mit Aluminiumfolie bedecken und bei 50 °C 20 min bebrüten. Bereiten Sie während dieser Inkubation eine Mucin-Nuklei-Färbungslösung vor (20 ng/mL 4,6-Diamidino-2-Phenylindole [DAPI], 1,6 g/ml Fluorescein-Isothiocyanat [FITC]-Lectin in PBS). Siehe Tabelle 1 für Beispielberechnungen. Für Magen und Dickdarm verwenden Sie FITC-Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1). Verwenden Sie für Dünndarm und Cecum eine Kombination aus FITC-UEA-1 und FITC-Weizenkeim Agglutinin (WGA).HINWEIS: Lektine verschiedener Arten erkennen unterschiedliche Zuckermodifikationen von Glykoproteinen wie Mucin. Die hier empfohlenen Lektinkombinationen wurden empirisch für eine optimale Färbung des Schleims in verschiedenen GI-Fächern bestimmt. Waschen Sie die Dias, indem Sie die FISH-Waschlösung ausgießen und das Glas mit RT PBS nachfüllen. Die PBS sofort abgießen und mit PBS auffüllen. Gießen Sie die PBS für insgesamt 2 Wärer. Wick weg die PBS mit einem empfindlichen Aufgabe Wischer Gewebe und kreisen Sie die Darmgewebe Abschnitt mit einem PAP-Stift. Legen Sie die Dias in einen undurchsichtigen Kunststoffbehälter und fügen Sie dem Gewebeabschnitt 50 L Mucin-Nuklei-Färbungslösung hinzu. Bedecken Sie den Behälter mit Aluminiumfolie, um vor Licht zu schützen. Bei 4 °C für 45 min inkubieren. Legen Sie die Dias in ein Coplin-Glas und waschen Sie sie schnell zweimal in PBS bei RT. Tippen Sie auf die überschüssige PBS auf einem Papiertuch und leiten Sie dann die letzten Tropfen PBS mit einem Gewebe ab. Legen Sie einen Tropfen Montagemedium auf jedem Abschnitt und überlagern Sie mit einem Glasdeckel, um Blasen zu verhindern. Lassen Sie das Montagemedium unter dem gesamten Deckschein verteilen. Zur sofortigen Bildgebung verankern Sie den Deckelrutsch mit Nagellack an den Ecken. Für die Langzeitlagerung, versiegeln Sie den Deckelrutsch mit Nagellack. Bildn istoren Sie die Dias mit einem Fluoreszenzmikroskop.