Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

De hieronder beschreven stappen zijn goedgekeurd door het UCSF institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC). 1. gastro-intestinale kolonisatie van muizen met C. albicans met behulp van orale gavage Voorzie in huisvesting voor 18 − 21 g mannelijke of vrouwelijke muizen (8 − 10 weken oud) zoals goedgekeurd door de lokale IACUC. Gebruik geautoclaveerd voedsel en water vanaf de eerste dag.Opmerking: Het gebruik van gesteriliseerde kooien, beddengoed, voedsel en water vermindert het risico van besmetting met antibiotica-resistente milieu bacteriën die C. albicans mogelijk van de darm kunnen verdringen. Verder moet, afhankelijk van de experimentele vraag, individuele huisvesting van dieren worden overwogen, omdat muizen coprofagisch zijn en de darminhoud wordt gedeeld tussen de huisdieren. De volgende dag, vervang het geautoclaveerd drinkwater met geautoclaveerd water met 5% glucose, 1.500 U/mL penicillaire G, en 2 mg/mL streptomycine. Bereid voor het gemak 200x antibiotica voorraadoplossingen (tabel 1) van tevoren, filter steriliseren en Vries bij-20 °c. Gedurende één weekdieren op antibiotica te houden. Op de dagen 3 en 6 nadat antibiotica zijn gestart, beoordelen de ontlasting van elk dier voor besmetting met antibiotica-resistente aërobe bacteriën. Het houden van een dier met één hand, plaats een niet-afgetopte microfugebuis buis in de buurt van de anus en het verzamelen van ten minste één fecale pellet. Respendeer elke fecale pellet in 1 ml steriel water en plaat 100 μL op Luria Bouillon (lb), gistextract pepton dextrose (yepd) of hersen hart infusie (BHI) plus bloedagar platen. Incubeer de platen ‘s nachts in een standaard incubator (niet anaerobe) bij 37 °C en evalueer de bacteriegroei.Opmerking: Platen moeten een minimale groei vertonen (0 − 20 kolonies). Als > 20 kolonies bacteriën worden teruggewonnen uit dieren die met penicilin en streptomycine worden behandeld, is het onwaarschijnlijk dat de kolonisatie op hoog niveau met C. albicans zal worden vastgesteld en het experiment moet worden afgebroken. Drie dagen voor de gavage, streak C. albicans van bevroren glycerol voorraden tot YEPD + 2% agar platen en inincuberen bij 30 °c gedurende 2 dagen. Een dag voor de sonde, inoculeren één kolonie van elke C. albicans stam te worden getest in 5 ml vloeibare YEPD. Incuberen bij 30 °C ‘s nachts met schudden. De ochtend van de maagsonde, Verdun de verzadigde cultuur van C. albicans tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,1 in 100 ml yepd voorverwarmd tot 30 °c. Schud in een rondschudapparaat bij 200 rpm bij 30 °C voor tussen 4 uur en 5 uur tot OD600 1 (Mid-log groei) bereikt. Breng elke 100 mL cultuur over naar 2 50 mL conische buizen en centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).Opmerking: C. albicans propageert relatief langzaam bij RT. Bij de aanpassing van dit protocol aan een andere soort moet de entmateriaal mogelijk op ijs worden gehouden om verdere groei te voorkomen. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de gepelleteerde cellen in 20 mL steriele zoutoplossing per 50 mL van de cultuur, en pool de dubbele geresuspendeerde pellets in enkele conische buizen. Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en regeer in 20 mL steriele zoutoplossing. Vortex kort en verwijder 20 μL voor OD600 meting. Verdun 1:50 in steriele normale zoutoplossing. Centrifugeer de overgebleven resuspendeerde cellen bij 3.000 x g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg. Voor een entmateriaal grootte van 1 x 108 CFU, respendeert de gepileerde cellen tot ongeveer 5 x 108 cfus/ml in steriele normale zoutoplossing op basis van de geschatte concentratie bepaald door od600 meting.Opmerking: Typisch, een OD600 van 1 komt overeen met ~ 1 x 107 gistcellen/ml. Deze waarde kan variëren per spectrofotometer en moet worden geverifieerd. Als een verandering in de concentratie gewenst is voor infecties met een ander micro-organisme, plan dan een entmateriaal volume van ≤ 10 μL/g muis om het ongemak voor het dier te minimaliseren. Controleer de concentratie van het entmateriaal door een 1:1000 verdunning met een hemocytometer te tellen. Stel het volume van de cellen die worden gavaged op basis van de concentratie bepaald met behulp van de hemocytometer. Gebruik een naald voor het voederen van dieren (Figuur 1A) en voer elk dier een maagsonde met het berekende volume van een gegeven entmateriaal. Zie de stappen 1.13.1 − 1.13.8 voor de maagsonde procedure.Opmerking: training voor maagsonde moet worden verkregen van een ervaren beoefenaar, en de procedure moet vooraf worden beheerst. Een succesvolle procedure voor een enkel dier duurt doorgaans niet langer dan 1 minuut. Bevestig een geautoclaveerd diervoeder naald aan een 1 ml spuit en vul de spuit met één maagsonde volume en verwijder eventuele luchtbelletjes om een onnauwkeurige dosis te voorkomen. Plaats op een steriel oppervlak. Verzeker het dier voor de maagsonde. Houd het dier aan de voet van de staart met de dominante hand en schuif niet-dominante hand omhoog van het dier terug naar de losse huid net achter de oren. Met behulp van de wijsvinger en duim van de niet-dominante hand, de losse huid samen te verzamelen strak; Dit is de “Scruff”. Pak het dier door zijn Scruff en lus kleine vinger van dezelfde (niet-dominante) hand rond de staart om het dier te immobiliseren tegen de Palm van de hand. Strek het hoofd van het dier voorzichtig uit zodat het hoofd en het lichaam (en dus de nek en de slokdarm) zich in een rechte lijn bevinden.Opmerking: Het proberen van een maagsonde terwijl het lichaam van het dier is gebogen of gedraaid kan leiden tot complicaties zoals oesofageale perforatie en overlijden van het dier. Neem de spuit met de dominante hand op en houd loodrecht op het dier, waarbij de gebogen naald naar beneden wijst (Figuur 1B). Met behulp van de bal van de naald, zachtjes haken een binnenste hoek van de mond, voorzichtig de naald langs de zijkant van de mond naar de achterkant van de keel, en tenslotte Beweeg de naald naar het centrum.Opmerking: Het introduceren van de naald langs een laterale pad helpt om weerstand van de tanden en tong van het dier te voorkomen. Wanneer de bal van de naald zich aan de achterkant van de keel bevindt, tilt u de naald omhoog zodat deze parallel is met de lichaams lijn van het dier (Figuur 1C).Opmerking: Op dit punt zal het dier een gag reflex vertonen. Dit is een goed teken dat aangeeft dat de naald correct gepositioneerd is, en de kokhalzen beweging helpt om de naald langs de slokdarm te leiden. Als er geen gag reflex, de naald kan worden in de luchtpijp in plaats van de slokdarm. Trek de naald voorzichtig uit en ga terug naar stap 1.13.1. Laat het dier het entmateriaal door slikken tot slechts enkele millimeter zichtbaar blijven (Figuur 1D). De naald soepel te laten verlopen.Opmerking: Als de naald niet verder, Vermijd het gebruik van kracht, die de slokdarm kan beschadigen. Soms is het voor de laatste halve centimeter een extra grote gag van het dier nodig. Als de naald lijkt vast te zitten, trekt u deze langzaam in en probeert u het opnieuw vanaf stap 1.13.4. Test of de bal van de naald zich op de juiste plaats bevindt (maag) door de zuiger zachtjes te bewegen. Als er geen weerstand is, blijf het inoculum leveren. Zodra het entmateriaal is toegediend, trekt u de naald langzaam terug. Vervang het dier in zijn kooi en blijf het dier gedurende 5 − 10 minuten controleren op tekenen van moeizame ademhaling of nood. Controleer of het dier de normale activiteit snel na de maagsonde hervat. Als hetzelfde entmateriaal met het volgende dier wordt gebruikt, reinig dan de naald met een alcoholdoekje. Ga terug naar stap 1.13.1. Als een ander entmateriaal wordt gebruikt, gebruik dan een nieuwe naald en ga terug naar stap 1.13.1.Opmerking: Het is belangrijk om dieren te inspecteren de dag na de maagsonde. Dieren die tekenen van nood vertonen (bijv. gejakte houding, moeizame ademhaling) moeten humaan worden geëoeid, omdat ze waarschijnlijk oesofageale breuk, beschadiging van de longen of een ander intern letsel hebben opgelopen waarvan het herstel onwaarschijnlijk is. Na de maagsonde van de dieren, plaat verdunningen van de entmateriaal voor dosis verificatie. Bereid 10-voudige seriële verdunningen tot 1:105. Plaat één maagsonde volume van de 1:105 verdunning op een 100 mm plaat van sabouraud dextrose agar. Incuberen de plaat gedurende 2 dagen bij 30 °C. Graaf CFUs om de dosis van het entmateriaal te bevestigen. 2. bereiding van gastro-intestinale weefsels voor histologie Opmerking: Dit deel van het protocol is aangepast van Johansson en Hansson16. Bereid 500 mL methacarn-oplossing (60% methanol, 30% chloroform, 10% ijsazijn) in een grote schroefdop plastic potje voor elke 2 dieren ontleed.Let op: Methanol en chloroform zijn schadelijk bij inademing en dienen te worden gemanipuleerd in een chemische afzuigkap. Ijsazijn kan corrosief zijn en moet worden behandeld met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Methanol, chloroform en ijsazijn moeten als gevaarlijk afval worden weggegooid. Op het experimentele eindpunt, euthaniteren dieren humaan volgens een protocol goedgekeurd door de lokale IACUC.Opmerking: Bij met antibiotica behandelde dieren varieert de kolonisatie van C. albicans meestal van ~ 106 cfus/g op dag 5 tot ~ 5 x 107 cfus/g op dag 25. Steriliseer dissectie gereedschap met 10% bleekwater en spoel met 70% ethanol. Beveilig elk dier tot een dissectie oppervlak, met een ventrale kant naar boven gericht. Gebruik 30 G naalden om de ledematen op het dissectie oppervlak te zetten (Figuur 2A). Spray het dier met 70% ethanol om de vacht te reinigen en het vasthouden aan de gereedschappen te minimaliseren. Knijp met een stompe-ended pincet in een gedeelte van de buikhuid met een niet-dominante hand. Met behulp van een schaar met een dominante hand, de huid en de onderliggende fascia in de buurt van de basis van het bekken. Strek de incisie in een U-vorm langs elke kant van de peritoneale Holte en tot aan de ribbenkast. Til de huid uit de weg. Met behulp van een potlood, prelabel histologie cassettes voor de te beoordelen GI-segmenten. Bijvoorbeeld, voor elk dier, label afzonderlijke cassettes als “maag,” “proximale dunne darmen,” “Mid dunne darmen,” “distale dunne darmen,” “Cecum,” en “grote darmen.” Plaats een schuimkussen op de onderkant van elke cassette (Figuur 2a).Opmerking: afbeelding 2B schetst voorgestelde secties om in cassettes te plaatsen. Met behulp van bot-ended Tang, voorzichtig uitpakken van de blindedarm uit de peritoneale holte. Gebruik een schaar om verbindingen tussen de blindedarm en de kleine en grote darmen te verbreken.Opmerking: Cecal weefsel is zeer delicaat en gemakkelijk te scheuren. Wees voorzichtig bij het manipuleren. Plaats de hele blindedarm in een histologie cassette zodat deze niet gedraaid is en plat ligt (Figuur 2C). Plaats een tweede schuimrubberen kussentje bovenop en sluit de cassette. Plaats de cassette in een schroefdop pot met methacarn. Accijns een deel van de dikke darmen dat 1 − 2 fecale pellets bevat, met een lengte kleiner dan die van de cassette. Plaats het weefsel gedeelte in de cassette, houd het weefsel plat en onverwrongen. Overlay met een tweede schuimkussen en sluit de cassette. Plaats de cassette in methacarn. Voor elke sectie van de kleine darmen te bemonsteren, accijns een 1 − 2 cm segment dat een aantal spijsverterings materiaal bevat. Plaats het segment in een histologie cassette, zodat het weefsel plat en onverwrongen blijft. Overlay met een tweede schuimkussen en sluit de cassette. Plaats de cassette in methacarn. Voor de maag, verbreken de verbindingen met de slokdarm en dunne darmen. Plaats in een cassette, houd het weefsel plat en onverwrongen. Overlay met een tweede schuimkussen en sluit de cassette. Plaats de cassette in methacarn. Laat de cassettes in methacarn-oplossing bij RT gedurende ten minste 3 uur en minder dan 2 weken.Opmerking: Er zijn verschillende punten gedurende welke de vaste GI-segmenten kunnen worden overgebracht naar een commerciële histologie dienst. Deze weefsels kunnen moeilijk in sectie zijn zonder verstoring van de Luminale inhoud, en optimale resultaten zullen worden verkregen door een ervaren technicus. Als de commerciële dienst bereid is om te wassen voordat de weefsels in paraffine worden ingesloten, kunnen de cassettes in dit stadium worden verzonden samen met instructies voor stap 2,16. Begin met het smelten van voldoende paraffinewas om alle weefsel cassettes in een groot bekerglas in een voorverwarmde 70 °C hybridisatie oven te bedekken. Na fixatie, verwijder de schuim pads en retourneer elke intact weefsel sectie terug in de cassette. Was de weefsels met de volgende oplossingen bij RT met schudden: tweemaal voor 35 min in 100% methanol, tweemaal gedurende 25 minuten in 100% ethanol, tweemaal gedurende 20 minuten in xyleen.Let op: Xyleen is ontvlambaar, giftig en kan bij inademing schade veroorzaken. Gebruik in een chemische afzuigkap met een goede bescherming. Gooi xyleen weg via gevaarlijke afval procedures. DEP de cassettes droog op een papieren handdoek en plaats deze in pregesmolten paraffinewas voor 2 uur bij 70 °C in een hybridisatie oven. Zorg ervoor dat de cassettes gevuld zijn met paraffine en dat er geen bubbels achterblijven.Opmerking: Deze stap stelt de wax in staat om het GI-segment te infiltreren en het weefsel en de inhoud te stabiliseren. Verwijder de cassettes van wax, laat de overtollige Wax uitlekken en bewaar ze bij RT totdat ze in Wax blokken zijn ingebed. Gooi de wax met sporen van xylenen weg als gevaarlijk afval.Opmerking: Het Noble Lab gebruikt een commerciële histologie dienst voor het insluiten en snijden van weefsels. Voor standaard visualisatie van C. albicans gisten en Hyphae worden 4 μm secties gebruikt. Voor het evalueren van de connectiviteit van hyphal segmenten, die doorgaans door meerdere vlakken reiken, kunnen 8 μm secties worden gebruikt. Afhankelijk van het vermogen van de VISSONDES om in het preparaat te dringen, kan het mogelijk zijn om nog dikkere delen te gebruiken. 3. validering van nieuw ontworpen sondes Opmerking: Het volgende protocol voor het valideren van C. albicans probes werd aangepast van Swidsinski et al.17. Streak C. albicans SC5314 en nauw verwante comparator soorten (bijv. Candida dubliniensis, Candida tropicalis) aan yepd + 2% agar platen. Incuberen gedurende 1 − 2 dagen bij 30 °C. Inoculeren 5 mL vloeibaar YEPD medium met een enkele kolonie. Pipetteer 1 mL van de hangende cellen in een micro centrifugebuis en centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 5 min. Gooi supernatant weg. Respendeer de pellet in 100 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Pipetteer 5 − 10 μL van geresuspendeerde cellen en spot op een glazen glijbaan. Verspreid in een grotere cirkel en laat drogen.Opmerking: Als cellen niet zijn aanhandig, gebruik poly-L-lysine gecoate dia’s. Omcirkel de celspot met een PAP-pen en dek af met 50 μL 2,5% Paraformaldehyde (PFA) in PBS. Incuberen bij RT gedurende 10 min.Let op: PFA is ontvlambaar en kan gezondheidsproblemen veroorzaken bij inademing of contact met de huid. Artikelen die met PFA zijn verontreinigd, moeten als gevaarlijk afval worden weggegooid. Was 3x met PBS. Tik op vloeistof uit op een papieren handdoek en dek af met 100 μL PBS. Herhaal dit twee keer. Gooi de laatste wasbeurt weg. Dia’s voorbereiden voor meerdaagse opslag. Als u vis op dezelfde dag uitvoert, gaat u verder met stap 3,9 zonder de stappen in deze sectie.Opmerking: het verdient de voorkeur om de hybridisatie onmiddellijk uit te voeren, maar als kort op tijd Volg stap 3,8 voordat u opslaat. Dia’s kunnen meerdere dagen op 4 °C worden bewaard. Bedek de spot met 60% ethanol. Incuberen bij RT gedurende 3 min. Gooi de oplossing weg. Bedek de spot met 80% ethanol. Incuberen bij RT gedurende 3 min. Gooi de oplossing weg. Bedek de spot met 100% ethanol. Incuberen bij RT gedurende 3 min. Gooi de oplossing weg. Ga verder naar stap 3,9. Plaats de lantaarnplaten afgedekt in een hybridisatie oven bij 50 °C gedurende 1 uur. Als stap 3,8 werd opgevolgd, bewaar de dia’s op 4 °C. Zo niet, ga dan naar stap 4,2 om het hybridisatie-protocol uit te voeren. 4. vis Skleuring in GI Tract weefsels Dewax paraffine-ingesloten histologische secties. In een hybridisatie oven preverwarm een Coplin jar gevuld met xyleen tot 60 °C. Plaats de glaasjes in de pot met xylene. Plaats bij 60 °c gedurende 10 min. Gooi de xyleen Wash weg. Bewaar de glaasjes in de pot en giet de xyleen in een afvalbak. Giet de verse RT xyleen in de pot en inincuberen bij 60 °C gedurende 10 min. Gooi de tweede xyleen was weg. Vul de pot met 100% ethanol en inincuberen bij RT gedurende 5 min. Verwijder de glaasjes uit de pot en de lucht drogen. Stel de hybridisatie oven in op 50 °C voor stappen in paragraaf 4,2. Vlek C. albicans met de vissonde. Bereid 1 mL verse hybridisatieoplossing (20 mM tris – HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfaat [SDS], 1% formamide in RNase-vrij water). Zie tabel 1 voor voorbeeld berekeningen. Meng samen 50 μL hybridisatieoplossing met 1 μL C. albicans sonde (5 ‘ CY3-ACAGCAGAAGCCGTGCC 3 ‘; 50 μg/ml in RNase-vrij water) voor een laatste sonde van 0,5 μg per dia.Opmerking: Veel laboratorium-gefokte muizen bevatten geen schimmels onder hun microbiota. In dit geval is het mogelijk om een pan-schimmel sonde (5 ‘ Cy3-CTCTGGCTTCACCCTATTC 3 ‘) te vervangen die 23S rRNA van de meeste schimmelsoorten herkent, niet alleen C. albicans. In de ervaring van de auteurs levert de panschimmel sonde helderdere kleuring dan de C. albicans-specifieke sonde. Bescherm de oplossing tegen licht en prewarm tot 50 °C. Teken met een PAP-pen een cirkel rond de weefsel sectie van punt 4,1. Pipetteer 50 μL sonde-bevattende hybridisatieoplossing op het vaste weefsel en verdeel zachtjes over de weefsel sectie met een pipetpunt. Overlay de vloeistof met een hybridisatie afdek waardoor bellen te voorkomen. DICHTING schuift in een waterdichte hybridisatie kamer en inbroed de delen gedurende 3 uur bij 50 °C in het donker in een hybridisatie oven. Bereid ondertussen 50 mL VISWASOPLOSSING (20 mM tris-HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl in RNase-vrij water). Zie tabel 1 voor voorbeeld berekeningen. Breng de wasoplossing naar 50 °C om te prewarmen. Voeg na 3 uur de wasoplossing toe aan een Coplin potje. Verwijder vervolgens voorzichtig de Afdeklijst van de glijbaan met de Tang en plaats de glijbaan in de wasoplossing. Bedek de pot met aluminiumfolie en inincuberen bij 50 °C gedurende 20 minuten. Bereid tijdens deze incubatie de mucin-nuclei-kleurings oplossing (20 ng/ml 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole [DAPI], 1,6 μg/ml fluoresceïne isothiocyanaat [FITC]-lectin in PBS). Zie tabel 1 voor voorbeeld berekeningen. Voor maag en grote darmen, gebruik FITC-ulex europaeus agglutinines 1 (UEA-1). Voor kleine darmen en Cecum, gebruik een combinatie van FITC-UEA-1 en FITC-tarwekiemen agglutinines (WGA).Opmerking: Lectines van verschillende soorten herkennen verschillende suiker modificaties van glycoproteïnen zoals mucine. De hier aanbevolen lectine combinaties werden empirisch bepaald voor optimale kleuring van slijm in verschillende GI compartimenten. Was de glijbanen door de VISWASOPLOSSING af te gieten en de pot opnieuw te vullen met RT PBS. Giet de PBS onmiddellijk af en vul aan met PBS. Giet de PBS af voor in totaal 2 wases. Weg de PBS met een delicate taak ruitenwisser weefsel en cirkel de intestinale weefsel sectie met een PAP pen. Plaats de dia’s in een ondoorzichtige plastic container en voeg 50 μL mucin-nuclei-kleurings oplossing toe aan de weefsel sectie. Bedek de container met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht. Inincuberen bij 4 °C gedurende 45 min. Plaats de dia’s in een Coplin jar en was snel tweemaal in PBS bij RT. Tik op een papieren handdoek op de overtollige PBS en geef de laatste druppels PBS met een tissue weg. Plaats één druppel afdekmedium op elke sectie en overlay met een glazen dekglaasje, voorkomt bubbels. Laat het afdekmedium zich onder de gehele Afdeklijst verspreiden. Voor onmiddellijke beeldvorming anker je de dekslip op zijn plaats met nagellak op de hoeken. Voor lange termijn opslag, afdichting rond de dekslip met nagellak. Afbeelding van de dia’s met behulp van een fluorescerende Microscoop.