التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت
Summary
الغرض من هذا البروتوكول هو تصور شكل خليه المبيضات الbicans والتعريب في الجهاز الهضمي الثدييات.
Abstract
المبيضات الbicans هو عنصر فطري من الجراثيم الأمعاء في البشر والعديد من الثدييات الأخرى. علي الرغم من ان c. مبيض لا يسبب اعراضا في معظم المضيفين المستعمرين ، والخزان المعلق لا يعمل كمستودع للامراض المعدية ، ويرتبط وجود الطفيليات الفطرية العالية في الأمعاء مع مرض التهاب الأمعاء. هنا ، ونحن وصف طريقه لتصور c. مبيض الشكل الخلية والتعريب في نموذج الماوس من الاستعمار المعدي المعوي مستقره. يتم تاسيس الاستعمار باستخدام جرعه واحده من c. مبيض في الكائنات التي عولجت مع المضادات الحيوية عن طريق الفم. يتم إصلاح شرائح من انسجه الأمعاء بطريقه تحافظ علي الهندسة المعمارية لمحتويات الاناره (الكائنات الحية المجهرية والمخاط) وكذلك الغشاء المخاطي المضيف. وأخيرا ، يتم تنفيذ التهجين الفلورسنت في الموقع باستخدام مجسات ضد rrna الفطرية إلى وصمه عار ل c. مبيض و هيبهاي. ومن المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول انه يسمح بالمراقبة المتزامنة لتشكل خليه c. مبيض وارتباطها المكاني مع الهياكل المضيفة اثناء الاستعمار الهضمي.
Introduction
المبيضات الbicans هو المعلق الفطرية ، فضلا عن الممرض البشري الانتهازي. هذه الخميرة تفتقر إلى المكانة البيئية المحددة وتنتشر بدلا من ذلك داخل الجهاز الهضمي (GI) المسالك ، والجلد ، والمسالك البولية التناسلية للبشر وغيرها من الثدييات1. في حين ركزت البحوث المبكرة علي c. مبيض في المقام الأول علي إمكاناتها ضراوة, وتشير العديد من التقارير الاخيره ان المعلقين نشر الكائنات داخل الأمعاء قد تلعب أدوارا هامه في الصحة الطبيعية, بما في ذلك التنمية المناعية لل المضيف2،3،4. لتسهيل التحقيقات في c. مبيض المعلقة داخل الأمعاء الثدييات ، وضعنا نموذج الماوس من الاستعمار الهضمي مستقره والتهجين في الموقع (الأسماك) القائم علي طريقه لتصور خلايا الخميرة الفطرية و هيبوهاي داخل التجويف المعوي.
مع بعض الاستثناءات5، الفئران المختبرة التي ولدت عاده ما تظهر مقاومه للاستعمار الفطرية في الجهاز الهضمي. ويعتقد ان المقاومة الاستعمار ان توسط من قبل الأنواع البكتيرية محدده; ومع ذلك ، يمكن التغلب علي هذا عن طريق العلاج من الحيوانية مع المضادات الحيوية6،7 أو استخدام نظامغذائي محدد كيميائيا التي يفترض ان يغير تكوين الأنواعالبكتيرية 8 ،9. المثل ، في البشر ، ارتبط استخدام المضادات الحيوية واسعه الطيف مع الإفراط في c. مبيض ونشر10. لدينا نموذج الاستعمار murine يستخدم المضادات الحيوية واسعه الطيف لإنشاء الاستعمار c. مبيض من الفئران المناعية ، تربي تقليديا. يتم توفير البنسلين والسستربتومايسين في مياه الشرب للحيوانات لمده أسبوع واحد قبل أنبوبي مع 108 مستعمره تشكيل وحدات (cfus) من c. albicans. طالما استمرت المياه التي غرست المضادات الحيوية, c. مبيض سوف تنتشر من خلال الجهاز الهضمي, الوصول إلى البراز من 106− 108 cfus/g. وعلي الرغم من ارتفاع مستوي الاستعمار الفطري ، تبقي الماشية صحية وتكتسب الوزن بنفس معدل التحكم غير المصاب. وقد استخدم هذا النموذج بنجاح لفحص وتوصيف العوامل المعلقة ج. مبيض المتعددة11,12.
مثل الأعضاء الآخرين في المملكة الفطرية ، c. مبيض قادر علي اللدونة المورفولوجية هائله13. تحت الظروف المختبرية, وقد ثبت ان الانتقال بين ما لا يقل عن سته أنواع الخلايا الخميرة أحاديه الخلية, فضلا عن هيبوهاي متعدد الخلايا و سودوهيهايهاي. الانتقال من الخميرة إلى حيفا هي واحده من سماتها الأكثر تميزا في الضراوة ، وتسود في معظم نماذج امراض الثدييات ، وكذلك في الانسجه البشرية المصابة. لتحديد التعريب c. مبيض والمورفولوجية الخلية داخل الجهاز الهضمي murine ، وضعنا تقنيه الأسماك لتلطيخ الخمائر و هيبوهاي في الأقسام النسيجية الثابتة. التحقيقات تتكون من فلوريسسينتلي المسمية الحمض النووي قله كريات الديك التي التهجين إلى الفطرية 23S ريبوسومال RNA (rRNA) ، والتي يتم توزيعها في جميع انحاء سيتوتوبلاسما الفطرية. لان يتم إصلاح الانسجه المضيف بطريقه تحافظ علي الهندسة المعمارية ثلاثية الابعاد من الأمعاء ، بما في ذلك الغشاء المخاطي المضيف ، والمواد الهضمية ، والجراثيم الجرثومية ، والمخاط داخل تجويف الأمعاء ، وهذه التقنية تسمح توطين الفطرية الخلايا فيما يتعلق بهذه المعالم عندما ملطخه. تقنيه الأسماك يقارن بشكل إيجابي إلى البقع النسيجية التقليدية للفطريات ، مثل الدوري حمض شيف (PAS) أو جوموري ميثينامين الفضة (GMS) ، فضلا عن الأجسام المضادة للفطريات المتاحة تجاريا ، لان هذه الكواشف ليست محدده C. albicans. وعلاوة علي ذلك ، فان المثبتات القياسية تزيل طبقه المخاط وتعطل المحتويات الأخرى لتجويف الأمعاء14،15.
في هذه المقالة ، ونحن نقدم تعليمات مفصله لإنشاء عاليه الجودة c. مبيض الاستعمار من الجهاز الهضمي الماوس ، لتشريح الجهاز الهضمي من الرحيم الحيوانية ، لتثبيت الانسجه بطريقه تحافظ علي الاناره الهندسة المعمارية ، والكشف عن c. مبيض داخل الانسجه المضيفة باستخدام الأسماك. بالاضافه إلى أنواع البرية وسلالات متحولة من c. albicans ، يمكن استخدام تقنيه أنبوبي لتسليم الكائنات المجهرية الأخرى. تقنيه التثبيت ستكون مفيده لأي دراسة فيها الحفاظ علي محتويات الأمعاء هو المطلوب. ويمكن الانتهاء من اجراء الأسماك في غضون يوم واحد ، ويمكن استخدامها لتوطين الأنواع الفطرية متعددة باستخدام متعددة ، والمسمي بشكل مختلف التحقيقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا يسمح لتصور c. مبيض الخمائر و هيبوهاي في مساحات GI من الفئران التي استعمرت المعلقين من اي جنس أو سلاله. المسبار الأسماك التهجين إلى rRNA 23S ، والتي يتم توزيعها في جميع انحاء سيتوتوبلاسما الفطرية. وقد تم تكييف طريقتنا من بروتوكول سبق الإبلاغ عنه لتصور بكتيريا الأمعاء20. لان c. مبيض يغير المورفولوجية في المضيف ، والأسلوب هو مفيد لرصد شكل الخلية الفطرية ، فضلا عن التعريب. علي سبيل المثال ، لقد استخدمنا هذه الطريقة لدحض فرضيه ان الخمائر تسود في جميع انحاء الجهاز الهضمي ، وفضح التناقضات بين في الجسم المجري والظاهري في المختبر من بعض “المسوخ-معيبه” طفرات12.
يوجد العديد من نماذج الماوس ل c. مبيض الاستعمار المعلق. والكائنات المجهرية لفئران المختبرات والبشر متميزة ، وفي الفئران ، يلزم استخدام المضادات الحيوية أو اتباع نظام غذائي متخصص لأقامه استعمار مستقر. العلاج بالمضادات الحيوية يعزز أيضا c. مبيض الاستعمار من البشر وهو عامل خطر كبير لنشر المرض10. المضادات الحيوية المستخدمة في هذه الدراسة غير مكلفه نسبيا وتسفر عن انخفاضات موثوقه في الجراثيم الجرثومية. لاحظ انه يتم استخدام المضادات الحيوية لإنقاص عبء الأنواع البكتيرية العدائية ، وليس للقضاء علي جميع البكتيريا من الكائنات. إذا كان الباحثون يرغبون في دراسة c. albicans-التفاعلات المضيف في غياب البكتيريا أو لتجنب استخدام المضادات الحيوية أو نظام غذائي خاص ، يمكن ان تحل محل الحيوانية الخالية من الجراثيم للحيوانات تربي تقليديا. ومع ذلك ، الفئران gnotobiotic تظهر بعض التشوات المناعية والتشريحية ، التالي قد لا تكون مناسبه لجميع الأغراض.
العديد من الخطوات الهامه لتلطيخ الأسماك الناجحة: طريقه التثبيت الموصي بها أمر بالغ الاهميه للحفاظ علي السلامة الهيكلية للانسجه الهضمية ، وخاصه المحتويات الهشة لتجويف الأمعاء ، مثل طبقه المخاط والثلاثية الابعاد تنظيم الفطريات والبكتيريا16. يرجى ملاحظه ان العديد من حلول التثبيت الشائعة الاستخدام التي تحتوي علي المياه تضر بشكل كبير بهندسة الاناره. المثبتات والحلول لغسل ما بعد التثبيت الموصي بها في هذا البروتوكول لا تحتوي علي الماء ، ومن المهم تجنب التلوث بالماء. خطوه حاسمه أخرى هي خطوه التهجين ، حيث انه من المهم تجنب تبخر محلول التهجين اثناء احتضان الشرائح في الفرن التهجين. نقترح وضع الشرائح في وعاء ماء لتجنب هذه المشكلة. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام غرف التهجين للماء مثل تلك التي تستخدم في الأصل لتهجين ميكروصفائف.
ويرد في هذا البروتوكول وصف لمسبار خاص بالأسماك من طراز c. مبيض. ومع ذلك ، لان العديد من الفئران التي تربي في المختبر لا تحتوي علي c. مبيض أو الفطريات الأخرى كجزء من الميكروبات المعوية الطبيعية ، والمسبار الفطري قد وصمه عار علي وجه التحديد c. مبيض في الكائنات المستعمرة بالتجربة. قد يكون من المرغوب فيه استبدال مسبار الفطرية بسبب خصائصه التهجين متفوقة واعلي نسبه الاشاره إلى الضوضاء. إذا تم استخدام المسبار الفطري كمسبار زائف لل c. مبيض، فمن المهم لتوثيق عدم وجود تلطيخ في الكائنات غير المصابة (اي ، التعامل مع المضادات الحيوية ولكن ليس c. مبيض). تلطيخ الحيوانية السيطرة غير المستعمرة هو أيضا مفيد لتقييم تلطيخ الخلفية التي قد تنجم عن التزام بتحقيقات الأسماك إلى الجسيمات الغذائية. وعموما ، فان استخدام تحقيقات الأسماك يوفر خصوصية محسنه علي معظم الطرق الأخرى لتلطيخ الفطريات ، مثل Calcofluor الأبيض (الذي البقع كيتين ، مكون جدار الخلية التي قد تختلف بين أنواع الخلايا) ، GMS ، أو الأجسام المضادة المضادة للفطريات المتاحة تجاريا. وعلاوة علي ذلك ، تلطيخ الأسماك يسمح لتكلفه الكائنات الحية المتعددة باستخدام بشكل مختلف المسمية تحقيقات الأسماك إلى الأنواع المحددة.
واحد التحذير من هذه التقنية هو ان بعض أنواع الخلايا الخميرة c. مبيض تظهر مشابهه جدا من قبل الأسماك (علي سبيل المثال ، وأنواع الخلايا غير الشفافة والأمعاء). للتمييز بين هذه الأنواع من الخلايا ، سيكون من المفيد تطوير تحقيقات التهجين إلى الخلية mRNAs الفطرية نوع محدد. ومع ذلك ، في شكله الحالي ، وقد كشفت تقنيه الأسماك بالفعل الاختلافات المفاجئة بين السلوكيات المجرية وفي المختبر من المسوخ c. مبيض تقييمها في اطار كلا الشرطين12، مشيرا إلى التفاعلات المعقدة في بيئة المعلق الطبيعية التي لا تحاكي بشكل كاف من قبل الموجودة في اختبارات المختبر. المزيد من الدراسات من البقع c. مبيض مختلفه في الأنواع البرية اضافيه والمضيفين متحولة من المرجح ان تسفر عن رؤى اضافيه في التفاعلات الفطرية المضيف. وعلي وجه الخصوص ، فانه سيكون من المفيد لتوصيف c. مبيض في نماذج من مرض التهاب الأمعاء ، والذي يرتبط مع فكسانال عاليه من c. مبيض في البشر21، وغيرها من نماذج c. مبيض فرط النمو والمرض. ويمكن أيضا الجمع بين تقنيه FISH مع مناعي لتلطيخ خلايا المضيف محدده. وعموما ، فان الطريقة المعروضة هنا توفر وسيله سريعة وموثوق بها إلى حد معقول لتحديد التوطين c. مبيض والتشكل داخل القناة الهضمية الثدييات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون ان يشكروا كارولينا تروتيني ، كاثرين نغ ، جوستين سوننبرغ ، وكيه كاي هوانغ للتوجيه في تطوير تقنيه الأسماك. قدمت تيريزا O’Meara تعليقات مفيده علي المخطوطة ، وساعدت ميريام ليفي في التصوير الفوتوغرافي. وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01AI108992 ، R01DK113788 ، وجائزه الترحيب Burخشونه في التسبب في الامراض المعدية.
Materials
| 1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
| BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
| C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
| chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
| chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
| DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
| delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
| D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
| ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
| feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
| FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
| FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
| Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
| formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
| glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
| glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
| Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
| hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
| hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
| LB | can be substituted from any vendor | ||
| Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
| methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
| mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
| paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
| parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
| PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
| penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
| Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
| saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
| super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
| xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
| YEPD | can be substituted from any vendor |
References
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Bacher, P., et al. Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans. Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).
- Shao, T. Y., et al. Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses. Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).
- Jiang, T. T., et al. Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria. Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).
- Iliev, I. D., et al. Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis. Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).
- Fan, D., et al. Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization. Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
- Yamaguchi, N., et al. Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets. Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).
- Kadosh, D., et al. Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).
- Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).
- Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
- Witchley, J. N., et al. Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection. Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice. Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).
- Guarner, J., Brandt, M. E. Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century. Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).
- Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).
- Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans. Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).
- Banerjee, M., et al. UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).
- Earle, K. A., et al. Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Sokol, H., et al. Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD. Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).
