Ensayos de cocultura de alto rendimiento para la investigación de interacciones microbianas

En la naturaleza, los microorganismos rara vez existen de forma aislada; consecuentemente, están constantemente interactuando con otros organismos. Por lo tanto, estudiar cómo los microorganismos interactúan entre sí es esencial para entender una multitud de comportamientos microbianos¹. Las interacciones microbianas pueden ser mutualistas, commensales o antagónicas. Estos en las teracciones pueden afectar no sólo a los propios microorganismos, sino también a los ambientes y huéspedes que los microorganismos colonizan^1,2.

Muchos científicos estudian las interacciones microbianas para identificar nuevas moléculas antimicrobianas. Una de las primeras moléculas antimicrobianas clínicamente importantes se encontró a través del estudio de interacciones microbianas. Sir Alexander Fleming observó un aislado de Penicillium spp. contaminante que inhibió el crecimiento de una cepa de Staphylococcus, que condujo al descubrimiento de la penicilina antibiótica comúnmente utilizada³. La caracterización de los mecanismos que utilizan los microorganismos para antagonizar a sus competidores sigue siendo un recurso fructífero para el descubrimiento de moléculas antimicrobianas. Por ejemplo, recientemente se demostró que Streptomyces sp. cepa Mg1 produce linealinas antibióticas, que tienen una actividad lítica y degradante contra Bacillus subtilis⁴.

Además, un péptido no ribosólomo sintetizado llamado lugdunin fue descubierto recientemente después de la observación de que la comensal nasal Staphylococcus lugdunensis inhibe Staphylococcus aureus⁵. Los estudios también han demostrado que las interacciones mutualistas entre microorganismos son tan poderosas como las interacciones antagónicas para el descubrimiento de moléculas antimicrobianas. Por ejemplo, muchas hormigas que cultivan hongos en la tribu Attini albergan bacterias simbióticas llamadas Pseudonocardia en su exoesqueleto que produce moléculas antifúngicas para inhibir un patógeno obligatorio de su cultivo de hongos^6. Como el estudio de las interacciones microbianas ha sido beneficioso para descubrir moléculas antimicrobianas, el uso de pantallas de alto rendimiento puede dar lugar al descubrimiento de nuevas moléculas antimicrobianas.

Con respecto al costo y la facilidad de rendimiento, las metodologías utilizadas para estudiar las interacciones microbianas van de simples a complejas. Por ejemplo, un ensayo de tapón de agar es un método económico y simple que se puede utilizar para investigar el antagonismo entre múltiples microorganismos⁷. Sin embargo, un ensayo de tapón de agar no es un procedimiento eficiente y puede ser laborioso para muchas combinaciones por pares. Para evaluar los efectos de los productos producidos microbianamente en los aislados objetivo de interés de una manera de alto rendimiento, muchos laboratorios utilizan ensayos de difusión de discos⁸. Estos ensayos son fáciles y económicos y pueden ser escalables a un mayor número de muestras⁷. Sin embargo, este ensayo requiere la generación de extractos microbianos y puede producir resultados engañosos para ciertas combinaciones de organismos objetivo y antibióticos, como Salmonella y cefalosporinas^9.

Los enfoques anteriores se basan en componentes aislados para dar lugar a una respuesta en un organismo objetivo, en lugar de permitir que los microorganismos interactúen entre sí. Esto es de nota porque las interacciones entre microbios pueden provocar la producción de moléculas antimicrobianas “crípticas” que no se producen en el monocultivo. Por ejemplo, recientemente se demostró que la keyicina antimicrobiana sólo es producida por un Micromonospora sp. cuando se co-cultiva con un Rhodococcus sp. que se aísla del mismo microbioma de esponja¹⁰. Las metodologías de interacción más complejas eluden este posible obstáculo monocultivo. Por ejemplo, el iChip es útil para aislar bacterias raras y difíciles de cultivar a partir de muestras ambientales y permite la observación de interacciones microbianas a través del crecimiento en el situ^11. Para investigar las interacciones en detalle, se puede utilizar la desorción/ionización por láser asistida por matriz con espectrometría de masas de imágenes de tiempo de vuelo (MALDI-TOF-IMS). Este enfoque proporciona información detallada sobre la composición y distribución de moléculas pequeñas y péptidos producidos por colonias microbianas interactuando con alta resolución espacial. MALDI-TOF-IMS también se ha utilizado en múltiples estudios de interacciones bacterianas para caracterizar los mecanismos de competencia^12,13,14,15. Sin embargo, MALDI-TOF-IMS a menudo requiere una laboriosa preparación de muestras, experiencia especializada para operar el equipo y espectrómetros de masas costosos y especializados. Por estas razones, es una técnica difícil de usar para estudios de alto rendimiento. Por lo tanto, un ensayo de cocultura simple, escalable y de alto rendimiento para interacciones microbianas que supere muchas limitaciones de los enfoques anteriores sería beneficioso.

Aquí, se presenta un protocolo para el cocultivo microbiano de alto rendimiento. Este ensayo es simple y fácilmente incorporado en estudios preexistentes de interacciones microbianas. A diferencia de muchos métodos comúnmente utilizados para el estudio de interacciones microbianas, nuestro método es simple, barato y es susceptible de investigar un gran número de interacciones. Estos ensayos no sólo son fáciles de realizar, sino que los materiales están ampliamente disponibles en la mayoría de los proveedores de laboratorio o recursos públicos (por ejemplo, bibliotecas y espacios de creadores). En consecuencia, este ensayo es ventajoso como primera línea de investigación para identificar y analizar patrones interesantes entre muchas combinaciones de microorganismos en pares, que pueden ser especialmente útiles para la investigación de la ecología microbiana.