Ensaios de co-cultura de alta produtividade para a investigação de interações microbianas

Na natureza, os microrganismos raramente existem isoladamente; Consequentemente, eles estão constantemente interagindo com outros organismos. Portanto, estudar como os microrganismos interagem entre si é essencial para a compreensão de uma multiplicidade de comportamentos microbianos¹. Interações microbianas podem ser mutualistas, comensais ou antagonistas. Estes em terações podem afetar não somente os micro-organismos eles mesmos mas também os ambientes e os anfitriões que os micro-organismos colonizam^1,2.

Muitos cientistas estudam interações microbianas para identificar novas moléculas antimicrobianas. Uma das primeiras moléculas antimicrobianas clinicamente importantes foi encontrada através do estudo das interações microbianas. Sir Alexander Fleming observou um isolado contaminante de Penicillium spp. que inibiu o crescimento de uma cepa de Staphylococcus , o que levou à descoberta da penicilina antibiótica comumente utilizada³. A caracterização dos mecanismos que os microrganismos usam para antagonizar seus concorrentes continua a ser um recurso frutífero para a descoberta de moléculas antimicrobianas. Por exemplo, foi demonstrado recentemente que a estirpe de Streptomyces SP. Mg1 produz linearmicinas antibióticas, que têm uma atividade lítica e degradativa contra Bacillus subtilis⁴.

Mais, um peptide não-ribosomally sintetizado nomeado lugdunin foi descoberto recentemente após a observação que o Staphylococcus comensal nasal Lugdunensis inibe o Staphylococcus aureus⁵. Estudos também mostraram que interações mutualistas entre microrganismos são igualmente poderosas como interações antagônicas para a descoberta de moléculas antimicrobianas. Por exemplo, muitas formigas que cultivam fungos na tribo Attini abrigam bactérias simbióticas chamadas Pseudonocardia em seu exoesqueleto que produz moléculas antifúngicas para inibir um patógeno obrigatório de sua cultura fúngica⁶. Como o estudo das interações microbianas tem sido benéfico para a descoberta de moléculas antimicrobianas, o uso de telas de alta taxa de transferência pode resultar na descoberta de novas moléculas antimicrobianas.

Com relação ao custo e à facilidade de desempenho, as metodologias utilizadas para estudar interações microbianas variam de simples a complexas. Por exemplo, um teste de plugue de agar é um método barato e simples que pode ser usado para investigar o antagonismo entre múltiplos microrganismos⁷. No entanto, um ensaio de plugue de agar não é um procedimento eficiente e pode ser trabalhoso para muitas combinações emparelhadas. Para avaliar os efeitos de produtos microbialmente produzidos em isolados alvo de interesse de uma forma de alta produtividade, muitos laboratórios utilizam ensaios de difusão de disco⁸. Estes ensaios são fáceis e baratos e podem ser dimensionáveis para números mais elevados de amostras⁷. No entanto, este ensaio requer a geração de extratos microbianos e pode produzir resultados enganosos para certas combinações de organismos-alvo e antibióticos, tais como salmonelas e cefalosporinas⁹.

As abordagens anteriores dependem de componentes isolados para provocar uma resposta em um organismo alvo, em vez de permitir que os microrganismos interajam uns com os outros. Isso é de notar porque as interações entre os micróbios podem provocar a produção de moléculas antimicrobianas “crípticas” que não são produzidas em monocultura. Por exemplo, foi demonstrado recentemente que a keyicina antimicrobiana só é produzida por um Micromonospora SP. quando cocultivado com um Rhodococcus SP. que é isolado do mesmo microbioma de esponja¹⁰. Metodologias de interação mais complexas contornam esse potencial obstáculo à monocultura. Por exemplo, o iChip é útil para isolar bactérias raras e difíceis de cultivar de amostras ambientais e permite a observação de interações microbianas através do crescimento in situ¹¹. Para investigar as interações em detalhe, a espectrometria de massa de imagem de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF-IMS) pode ser usada. Essa abordagem fornece informações detalhadas sobre a composição e distribuição de pequenas moléculas e peptídeos produzidos por colônias microbianas interagindo com alta resolução espacial. MALDI-TOF-IMS também tem sido utilizado em múltiplos estudos de interações bacterianas para caracterizar os mecanismos de competição^12,13,14,15. No entanto, MALDI-TOF-IMS muitas vezes requer preparação de amostra trabalhoso, especialização especializada para operar o equipamento, e espectrómetros de massa caros e especializados. Por estas razões, é uma técnica difícil de usar para estudos de alta taxa de transferência. Assim, um ensaio de cocultura simples, escalável e de alta taxa de transferência para interações microbianas que supera muitas limitações das abordagens acima seria benéfico.

Aqui, um protocolo para a cocultura microbiana da taxa de transferência elevada é apresentado. Este ensaio é simples e facilmente incorporado em estudos pré-existentes de interações microbianas. Em contraste com muitos métodos comumente usados para o estudo de interações microbianas, nosso método é simples, barato, e é capaz de investigar um grande número de interações. Estes ensaios não são apenas fáceis de executar, mas os materiais estão amplamente disponíveis a partir da maioria dos fornecedores de laboratórios ou recursos públicos (por exemplo, bibliotecas e makerspaces). Consequentemente, este ensaio é vantajoso como uma primeira linha de investigação para identificar e analisar padrões interessantes entre muitas combinações emparelhadas de microrganismos, o que pode ser especialmente útil para a investigação da ecologia microbiana.