微生物相互作用の調査のための高スループット共培養アッセイ
Summary
このプロトコルで提示される共培養相互作用アッセイは、安価で高いスループットとシンプルです。これらのアッセイは、共培養における微生物相互作用を観察し、相互作用パターンを同定し、ヒトおよび環境病原体に対する関心のある微生物株の阻害可能性を特徴付けるために使用することができる。
Abstract
微生物同士の相互作用の研究は、新しい抗菌薬から微生物生態学の洞察まで、数多くの発見につながっています。微生物相互作用の研究に使用される多くのアプローチは、特殊な機器を必要とし、高価で時間の多い。本論文では、安価で、大きなサンプル数にスケーラブルで、多数の実験計画に容易に適応できる共培養相互作用アッセイのプロトコルを提示する。微生物は一緒に培養され、それぞれが微生物の1対ごとの組み合わせを表す。試験生物は、各井戸の片側で培養され、最初に単一培養でインキュベートされる。その後、標的生物は、3Dプリントされた接種スタンプを使用して、各井戸の反対側に同時に接種される。共培養後、完成したアッセイは、成長または阻害などの視覚表現型についてスコア付けされます。これらのアッセイは、表現型を確認したり、目的の単離物間のパターンを同定するために使用することができます。この簡単で効果的な方法を使用して、ユーザーは微生物の組み合わせを迅速かつ効率的に分析することができます。この共培養アプローチは、抗生物質の発見と培養性マイクロバイオーム研究に適用可能であり、すでに両方の用途に応用されています。
Introduction
自然界では、微生物が単独で存在することはめったにない。その結果、彼らは常に他の生物と相互作用しています。したがって、微生物同士の相互作用を研究することは、多数の微生物挙動を理解するために不可欠である1.微生物相互作用は、相互主義的、共生的、または敵対的である可能性があります。これらのテラクションは、微生物自体だけでなく、微生物が1、2を植民地化する環境や宿主にも影響を与える可能性があります。
多くの科学者は、新しい抗菌分子を同定するために微生物相互作用を研究しています。最初の臨床的に重要な抗菌分子の1つは、微生物相互作用の研究を通じて見出された。サー・アレクサンダー・フレミングは、ブドウ球菌株の増殖を阻害する汚染ペニシリウム菌株を観察し、一般的に使用される抗生物質ペニシリン3の発見につながった。微生物が競合他社に敵対するために使用するメカニズムの特性は、抗菌分子の発見のための実りある資源のままです。例えば、最近、ストレプトマイセスsp.株Mg1が抗生物質リアーミシンを産生し、バチルス亜チリス4に対して溶解および分解活性を有することが示された。
さらに、ラグドゥニンという名前の非リボソマ的に合成されたペプチドは、最近、鼻の共生黄色ブドウ球菌ラグデネンシスが黄色ブドウ球菌5を阻害することを観察した後に発見された。研究はまた、微生物間の相互的相互作用が抗菌分子の発見のための拮抗相互作用と同じくらい強力であることを示しています。例えば、部族アッティーニ港の多くの真菌養殖アリは、彼らの真菌作物6の義務病原体を阻害する抗真菌分子を産生する外骨格上のシュードノカルディアと呼ばれる共生細菌を持っています。微生物相互作用の研究は抗菌分子の発見に有益であったので、高スループットスクリーンの使用は、新しい抗菌分子の発見をもたらす可能性があります。
コストとパフォーマンスの容易さに関しては、微生物相互作用を研究するために使用される方法論は、単純なものから複雑なものまで多い。例えば、寒天プラグアッセイは、複数の微生物間の拮抗作用7を調べるために使用することができる安価で簡単な方法である。しかし、寒天プラグアッセイは効率的な手順ではなく、多くのペアワイズの組み合わせに対して労働集約的な場合があります。高スループット方評による対象単離物に対する微生物生成製品の影響を評価するために、多くの研究室ではディスク拡散アッセイ8を使用しています。これらのアッセイは簡単で安価であり、より多くのサンプル7にスケーラブルにすることができます。しかし、このアッセイは微生物抽出物の生成を必要とし、サルモネラ菌およびセファロスポリン9などの標的生物および抗生物質の特定の組み合わせに対して誤解を招く結果を生じる可能性がある。
上記のアプローチは、微生物が相互に相互作用することを可能にするのではなく、標的生物で応答を引き出すために分離された成分に依存しています。これは、微生物間の相互作用が単培養では生成されない「不可解な」抗菌分子の産生を引き起こす可能性があるためです。例えば、抗菌性キーイシンは、同じスポンジマイクロバイオーム10から単離されたロドコッカスsp.と共培養した場合にのみ、マイクロモノスポラspによって産生されることが最近示された。より複雑な相互作用の方法論は、この潜在的な単一培養の障害を回避する。例えば、iChipは、環境サンプルから細菌を培養するのが困難な希少かつ困難な分離に有用であり、その現場11における増殖を通じて微生物相互作用の観察を可能にする。相互作用を詳細に調べるには、マトリックスアシストレーザー脱着/イオン化飛行時間イメージング質量分析(MALDI-TOF-IMS)を使用することができます。このアプローチは、高い空間分解能を有する微生物コロニーとの相互作用によって生成される小分子およびペプチドの組成および分布に関する詳細な情報を提供する。MALDI-TOF-IMSはまた、競争12、13、14、15のメカニズムを特徴付けるために細菌相互作用の複数の研究で使用されている。しかし、MALDI-TOF-IMSは、多くの場合、手間のかかるサンプル調製、機器を操作するための専門的な専門知識、および高価で特殊な質量分析計を必要とします。これらの理由から、高スループットスタディに使用するのは困難な手法です。したがって、上記のアプローチの多くの制限を克服する微生物相互作用のためのシンプルでスケーラブルで高スループットの共培養アッセイが有益であろう。
ここでは、高スループット微生物共培養のためのプロトコルが提示される。このアッセイは、単純かつ容易に微生物相互作用の既存の研究に組み込まれています。微生物相互作用の研究に一般的に使用される多くの方法とは対照的に、我々の方法は、シンプルで安価であり、多数の相互作用を調査するのに適しています。これらのアッセイは、実行が容易であるだけでなく、材料は、ほとんどの実験室のサプライヤーや公共のリソース(例えば、図書館やメーカースペース)から広く利用可能です。したがって、このアッセイは、微生物の多くのペアワイズの組み合わせの間で興味深いパターンを同定し、解析するための調査の第一線として有利であり、微生物生態学の調査に特に有用であり得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
微生物相互作用を媒理化する抗生物質およびその他の二次代謝産物は、創薬を含む多数のアプリケーションに有用である。本明細書では、多数の微生物相互作用を評価する共培養アッセイのためのプロトコルが提示される。これらの共培養インタラクションアッセイは、シンプルで手頃な価格、スケーラブル、および高スループットの手段で、多くの微生物の組み合わせを組み合わせて調べ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿を批判的に読んでくれたダニエル・メイ、マーク・シェブレット、ドン・ホアンに感謝します。この研究は、キャメロン・R・カリーの取り組みを含め、ウィスコンシン大学マディソン校の研究・大学院教育担当副首相事務所の支援を受け、ウィスコンシン州同窓会研究財団からの資金提供を受けました。国立国立保健研究所翻訳研究のための卓越性(U19-AI109673-01)。リード・M・スタブベンディックは、国立医学図書館の生物学・医学研修プログラム(NLM 5T15LM007359)の計算と情報に対する研修助成金によって支援されました。資金提供者は、研究の設計、データ収集、解釈、または出版物のために作品を提出する決定に役割を持ちはありませんでした。
Materials
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
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