Analisi di cocultura ad alta produttività per l'analisi delle interazioni microbiche

In natura, i microrganismi raramente esistono in isolamento; di conseguenza, interagiscono costantemente con altri organismi. Pertanto, studiare come i microrganismi interagiscono tra loro è essenziale per comprendere una moltitudine di comportamenti microbici¹. Le interazioni microbiche possono essere mutualistiche, commensal o antagoniste. Questi in terazioni possono influenzare non solo i microrganismi stessi, ma anche gli ambienti e gli host che i microrganismi colonizzano^1,2.

Molti scienziati studiano le interazioni microbiche per identificare nuove molecole antimicrobiche. Una delle prime molecole antimicrobiche clinicamente importanti è stata trovata attraverso lo studio delle interazioni microbiche. Sir Alexander Fleming osservato un contaminante Penicillium spp. isolare che ha inibito la crescita di un ceppo Staphylococcus, che ha portato alla scoperta della penicillina antibiotica comunemente usato^{3 .} La caratterizzazione dei meccanismi utilizzati dai microrganismi per antagonizzare i loro concorrenti rimane una risorsa fruttuosa per la scoperta di molecole antimicrobiche. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che Streptomyces sp. ceppo Mg1 produce linearizzate antibiotiche, che hanno un’attività littica e degradante contro Bacillus subtilis⁴.

Inoltre, un peptide non-ribosomially sintetizzato chiamato lugdunin è stato recentemente scoperto dopo l’osservazione che nasale commensal Staphylococcus lugdunensis inibisce Staphylococcus aureus⁵. Gli studi hanno anche dimostrato che le interazioni mutualistiche tra microrganismi sono altrettanto potenti delle interazioni antagoniste per la scoperta di molecole antimicrobiche. Ad esempio, molte formiche che coltivano funghi nella tribù Attini porto batteri simbiotici chiamati Pseudonocardia sul loro esoscheletro che produce molecole antifungini per inibire un patogeno obbligatorio della loro coltura fungina⁶. Poiché lo studio delle interazioni microbiche è stato utile per scoprire molecole di antimicrobici, l’uso di schermi ad alta velocità potrebbe portare alla scoperta di nuove molecole antimicrobiche.

Per quanto riguarda i costi e la facilità di prestazione, le metodologie utilizzate per studiare le interazioni microbiche vanno da semplici a complesse. Per esempio, un saggio agar plug è un metodo economico e semplice che può essere utilizzato per studiare l’antagonismo tra più microrganismi⁷. Tuttavia, un saggio agar plug non è una procedura efficiente e può essere laborioso per molte combinazioni a coppie. Per valutare gli effetti dei prodotti prodotti microbicamente sugli isolati di destinazione di interesse in modo ad alta produttività, molti laboratori utilizzano analisi di diffusione del disco⁸. Questi saggi sono facili e poco costosi e possono essere scalabili a un numero più elevato di campioni⁷. Tuttavia, questo test richiede la generazione di estratti microbici e può produrre risultati fuorvianti per alcune combinazioni di organismi bersaglio e antibiotici, come Salmonella e cefalosporine⁹.

Gli approcci precedenti si basano su componenti isolati per suscitare una risposta in un organismo bersaglio, invece di consentire ai microrganismi di interagire tra loro. Questo è interessante perché le interazioni tra microbi possono provocare la produzione di molecole antimicrobiche “criptiche” che non sono prodotte in monocoltura. Per esempio, è stato recentemente dimostrato che la chiavetina antimicrobica è prodotta solo da un Micromonospora sp. quando co-collezionato con un Rhodococcus sp. che è isolato dallo stesso microbioma di spugna¹⁰. Metodologie di interazione più complesse aggirano questo potenziale ostacolo alla monocultura. Ad esempio, l’iChip è utile per isolare batteri rari e difficili da coltivare da campioni ambientali e consente l’osservazione delle interazioni microbiche attraverso la crescita in situ¹¹. Per studiare le interazioni in dettaglio, è possibile utilizzare la spettrometria di massa di massa di massa di imaging laser assistita a matrice (MALDI-TOF-IMS). Questo approccio fornisce informazioni dettagliate sulla composizione e la distribuzione di piccole molecole e peptidi prodotti da colonie microbiche interagenti ad alta risoluzione spaziale. MALDI-TOF-IMS è stato utilizzato anche in molteplici studi sulle interazioni batteriche per caratterizzare i meccanismi della concorrenza^12,13,14,15. Tuttavia, MALDI-TOF-IMS spesso richiede una laboriosa preparazione del campione, competenze specializzate per il funzionamento delle apparecchiature e costosi spettrometri di massa. Per questi motivi, è una tecnica difficile da utilizzare per gli studi ad alta velocità effettiva. Pertanto, sarebbe utile un saggio di cocultura semplice, scalabile e ad alto throughput per le interazioni microbiche che supera molte limitazioni degli approcci di cui sopra.

In questo caso, viene presentato un protocollo per la cocultura microbica ad alta produttività. Questo saggio è semplice e facilmente incorporato negli studi preesistenti sulle interazioni microbiche. A differenza di molti metodi comunemente usati per lo studio delle interazioni microbiche, il nostro metodo è semplice, poco costoso ed è suscettibile di studiare un gran numero di interazioni. Questi saggi non sono solo facili da eseguire, ma i materiali sono ampiamente disponibili dalla maggior parte dei fornitori di laboratorio o delle risorse pubbliche (ad esempio, biblioteche e spazi per maker). Di conseguenza, questo saggio è vantaggioso come prima linea di indagine per identificare e analizzare modelli interessanti tra molte combinazioni a coppie di microrganismi, che possono essere particolarmente utili per lo studio dell’ecologia microbica.