High Throughput Co-Culture Assays für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen

In der Natur existieren Mikroorganismen selten isoliert; folglich interagieren sie ständig mit anderen Organismen. Daher ist es wichtig, zu untersuchen, wie Mikroorganismen miteinander interagieren, um eine Vielzahl von mikrobiellen Verhaltensweisen zu verstehen¹. Mikrobielle Wechselwirkungen können gegenseitigkeits-, kominsiver oder antagonistischer sein. Diese In-teractions können nicht nur die Mikroorganismen selbst beeinflussen, sondern auch die Umgebungen und Wirte, die die Mikroorganismen besiedeln^1,2.

Viele Wissenschaftler untersuchen mikrobielle Wechselwirkungen, um neue antimikrobielle Moleküle zu identifizieren. Eines der ersten klinisch wichtigen antimikrobiellen Moleküle wurde durch die Untersuchung von mikrobiellen Wechselwirkungen gefunden. Sir Alexander Fleming beobachtete ein kontaminierendes Penicillium spp. Isolat, das das Wachstum eines Staphylococcus-Stamms hemmte, was zur Entdeckung des häufig verwendeten Antibiotikums Penicillin³führte. Die Charakterisierung der Mechanismen, die Mikroorganismen verwenden, um ihre Konkurrenten zu verärgern, bleibt eine fruchtbare Ressource für die Entdeckung antimikrobieller Moleküle. Zum Beispiel wurde kürzlich gezeigt, dass Streptomyces sp. Stamm Mg1 antibiotische Linearmycine produziert, die eine lytische und abbauende Wirkung gegen Bacillus subtilis⁴haben.

Darüber hinaus wurde kürzlich ein nicht-ribosomal synthetisiertes Peptid namens Lugdunin entdeckt, nachdem festgestellt wurde, dass der nasale Commensal Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus aureus⁵hemmt. Studien haben auch gezeigt, dass mutualistische Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen ebenso stark sind wie antagonistische Wechselwirkungen für die Entdeckung antimikrobieller Moleküle. Zum Beispiel beherbergen viele pilzbewirtschaftende Ameisen im Stamm Attini symbiotische Bakterien namens Pseudonokardie auf ihrem Exoskelett, das antimykotische Moleküle produziert, um einen obligaten Erreger ihrer Pilzernte zu hemmen⁶. Da die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen für die Entdeckung antimikrobieller Moleküle von Vorteil war, kann die Verwendung von Bildschirmen mit hohem Durchsatz zur Entdeckung neuer antimikrobieller Moleküle führen.

In Bezug auf die Kosten und die Leichtigkeit der Leistung reichen die Methoden zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen von einfach bis komplex. Zum Beispiel ist ein Agar-Plug-Assay eine kostengünstige und einfache Methode, die verwendet werden kann, um Antagonismus zwischen mehreren Mikroorganismen zu untersuchen⁷. Ein Agar-Plug-Assay ist jedoch kein effizientes Verfahren und kann für viele paarweise Kombinationen arbeitsintensiv sein. Um die Auswirkungen mikrobiell hergestellter Produkte auf Zielisolate mit hohem Durchsatz zu bewerten, verwenden viele Laboratorien Plattendiffusionstests⁸. Diese Assays sind einfach und kostengünstig und können auf eine höhere Anzahl von Proben^skalierbarsein 7 . Dieser Test erfordert jedoch die Erzeugung von mikrobiellen Extrakten und kann irreführende Ergebnisse für bestimmte Kombinationen von Zielorganismen und Antibiotika wie Salmonellen und Cephalosporinen⁹produzieren.

Die vorhergehenden Ansätze basieren auf isolierten Komponenten, um eine Reaktion in einem Zielorganismus auszulösen, anstatt Mikroorganismen die Interaktion miteinander zu ermöglichen. Dies ist bemerkenswert, da Wechselwirkungen zwischen Mikroben die Produktion von “kryptischen” antimikrobiellen Molekülen auslösen können, die nicht in monokultural produziert werden. So wurde kürzlich gezeigt, dass das antimikrobielle Keyicin nur von einem Micromonospora sp. produziert wird, wenn es mit einem Rhodococcus sp. kokultiviert wird, der aus dem gleichen Schwammmikrobiom¹⁰isoliert ist. Komplexere Interaktionsmethoden umgehen dieses potenzielle Monokulturhindernis. Zum Beispiel ist der iChip nützlich für die Isolierung seltener und schwer zu kultivierender Bakterien aus Umweltproben und ermöglicht die Beobachtung mikrobieller Wechselwirkungen durch Wachstum in situ¹¹. Um Wechselwirkungen im Detail zu untersuchen, kann eine matrixgestützte Laser-Desorption/Ionisationszeit-of-Flight-Bildgebungs-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-IMS) verwendet werden. Dieser Ansatz liefert detaillierte Informationen über die Zusammensetzung und Verteilung von kleinen Molekülen und Peptiden, die durch interagierende mikrobielle Kolonien mit hoher räumlicher Auflösung erzeugt werden. MALDI-TOF-IMS wurde auch in mehreren Studien von bakteriellen Wechselwirkungen verwendet, um die Mechanismen des Wettbewerbs^12,13,14,15zu charakterisieren. MALDI-TOF-IMS erfordert jedoch oft eine aufwendige Probenvorbereitung, spezielles Know-how für den Betrieb der Geräte sowie teure und spezialisierte Massenspektrometer. Aus diesen Gründen ist es eine schwierige Technik für Studien mit hohem Durchsatz zu verwenden. Daher wäre ein einfacher, skalierbarer und hoher Durchsatz-Co-Kultur-Assay für mikrobielle Wechselwirkungen, der viele Einschränkungen der oben genannten Ansätze überwindet, von Vorteil.

Hier wird ein Protokoll für die mikrobielle Kokultur mit hohem Durchsatz vorgestellt. Dieser Test ist einfach und leicht in bereits bestehende Studien über mikrobielle Wechselwirkungen integriert. Im Gegensatz zu vielen häufig verwendeten Methoden zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen ist unsere Methode einfach, kostengünstig und kann eine große Anzahl von Wechselwirkungen untersuchen. Diese Assays sind nicht nur einfach durchzuführen, sondern die Materialien sind bei den meisten Laborlieferanten oder öffentlichen Ressourcen (z. B. Bibliotheken und Makerspaces) weit verbreitet. Folglich ist dieser Test als erste Untersuchungslinie vorteilhaft, um interessante Muster unter vielen paarweisen Kombinationen von Mikroorganismen zu identifizieren und zu analysieren, was besonders für die Untersuchung der mikrobiellen Ökologie nützlich sein kann.