Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties

In de natuur bestaan micro-organismen zelden geïsoleerd; Dientengevolge, ze zijn voortdurend interactie met andere organismen. Daarom is het essentieel om een veelheid van microbiële gedragingen te begrijpen¹, om te bestuderen hoe micro-organismen met elkaar omgaan. Microbiële interacties kunnen mutualistisch, commensaal of antagonistisch zijn. Deze in teractions kan invloed hebben op niet alleen de micro-organismen zelf, maar ook de omgevingen en hosts die de micro-organismen koloniseren^1,2.

Veel wetenschappers bestuderen microbiële interacties om nieuwe antimicrobiële moleculen te identificeren. Een van de eerste klinisch belangrijke antimicrobiële moleculen werd gevonden door de studie van microbiële interacties. Sir Alexander Fleming observeerde een contaminerend Penicillium spp. isolaat dat de groei van een Staphylococcus -stam inhiemde, wat leidde tot de ontdekking van de veelgebruikte antibiotica penicillaire³. Karakterisering van de mechanismen die micro-organismen gebruiken om hun concurrenten te antagoniseren blijft een vruchtbare bron voor de ontdekking van antimicrobiële moleculen. Bijvoorbeeld, het werd onlangs aangetoond dat Streptomyces SP. stam Mg1 produceert antibioticum linearmycinen, die hebben een lytische en degradatieve activiteit tegen Bacillus subtilis⁴.

Verder werd een niet-ribosomaal gesynthetiseerd peptide, genaamd lugdunin, onlangs ontdekt na de constatering dat de nasale commensale Staphylococcus Lugdunensis Staphylococcus aureus⁵remt. Studies hebben ook aangetoond dat mutualistische interacties tussen micro-organismen even krachtig zijn als antagonistische interacties voor de ontdekking van antimicrobiële moleculen. Bijvoorbeeld, veel schimmel-landbouw mieren in de stam attini haven symbiotische bacteriën genoemd pseudonocardia op hun exoskelet die schimmelwerende moleculen produceert voor de remming van een verplicht pathogeen van hun schimmel gewas⁶. Omdat de studie van microbiële interacties gunstig is geweest voor het ontdekken van antimicrobiële moleculen, kan het gebruik van hoge doorvoer schermen resulteren in de ontdekking van nieuwe antimicrobiële moleculen.

Met betrekking tot de kosten en het gemak van de prestaties, de methoden die worden gebruikt voor het bestuderen van microbiële interacties variëren van eenvoudig tot complex. Een agar-plug assay is bijvoorbeeld een goedkope en eenvoudige methode die kan worden gebruikt om antagonisme tussen meerdere micro-organismen⁷te onderzoeken. Een agar-plug assay is echter geen efficiënte procedure en kan arbeidsintensief zijn voor veel Pairwise-combinaties. Om de effecten van microbieel geproduceerde producten op doel isolaten van belang in een hoge doorvoer manier te beoordelen, gebruiken veel laboratoria schijf diffusie testen⁸. Deze assays zijn gemakkelijk en goedkoop en kunnen schaalbaar zijn tot hogere aantallen monsters⁷. Deze bepaling vereist echter het opwekken van microbiële extracten en kan misleidende resultaten opleveren voor bepaalde combinaties van doelorganismen en antibiotica, zoals salmonella en cefalosporinen⁹.

De voorgaande benaderingen zijn afhankelijk van geïsoleerde componenten om een reactie te lokken in een doelorganisme, in plaats van het toestaan van micro-organismen om met elkaar te communiceren. Dit is van merk, omdat de interacties tussen microben kan de productie van “cryptische” antimicrobiële moleculen die niet worden geproduceerd in monocultuur ontlokken. Bijvoorbeeld, het werd onlangs aangetoond dat de antimicrobiële keyicin alleen wordt geproduceerd door een Micromonospora SP. Wanneer co-gekweekte met een Rhodococcus SP. dat is geïsoleerd van dezelfde spons microbiome¹⁰. Complexere interactie methodieken omzeilen deze potentiële monocultuur belemmering. De iChip is bijvoorbeeld handig voor het isoleren van zeldzame en moeilijk te kweken bacteriën uit milieu monsters en maakt het mogelijk om microbiële interacties te observeren door middel van groei in situ¹¹. Om interacties in detail te onderzoeken, kan matrix geassisteerde Laser desorptie/ionisatie time-of-Flight Imaging Mass spectrometrie (MALDI-TOF-IMS) worden gebruikt. Deze aanpak biedt gedetailleerde informatie over de samenstelling en distributie van kleine moleculen en peptiden geproduceerd door het interageren van microbiële kolonies met een hoge ruimtelijke resolutie. MALDI-tof-IMS is ook gebruikt in meerdere studies van bacteriële interacties om de mechanismen van de competitie te karakteriseren^12,13,14,15. Echter, MALDI-TOF-IMS vereist vaak bewerkelijk monstervoorbereiding, gespecialiseerde expertise om de apparatuur te bedienen, en dure en gespecialiseerde massaspectrometers. Om deze redenen is het een moeilijke techniek om te gebruiken voor studies met een hoge doorvoer. Dus, een eenvoudige, schaalbare en co-cultuur test met hoge doorvoer voor microbiële interacties die veel beperkingen van de bovenstaande benaderingen overkomt, zou gunstig zijn.

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een hoge doorvoer van microbiële co-cultuur. Deze test is eenvoudig en gemakkelijk te integreren in reeds bestaande onderzoeken naar microbiële interacties. In tegenstelling tot veel veelgebruikte methoden voor de studie van microbiële interacties, onze methode is eenvoudig, goedkoop, en is vatbaar voor onderzoek naar grote aantallen interacties. Deze testen zijn niet alleen gemakkelijk uit te voeren, maar de materialen zijn op grote schaal verkrijgbaar bij de meeste laboratorium leveranciers of openbare bronnen (bijv. bibliotheken en makerspaces). Bijgevolg is deze test voordelig als een eerste onderzoekslijn om interessante patronen te identificeren en te parseren tussen vele combinaties van micro-organismen, die vooral nuttig kunnen zijn voor het onderzoek naar microbiële ecologie.