Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Laboratuvar farelerinin bakımı ve tüm deneyler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin ilgili yönerge ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Ekipman ve Reaktif Kurulumu Su banyosunu 37 °C’ye ayarlayın. Hücre kültürünü 34 °C, %5 CO2, nem oranına ayarlayın. Tüp rotator’u kuvöze koy.NOT: Kuvözlerin iç sıcaklığını değiştirmesi uzun zaman alar. Sürekli olarak 34 °C’de ayarlanmış bir kuluçka makinesi yoksa, deneyden 1 gün önce bir tane ayarlayın. Uygun miktarda mikroskopi cam slayt hazırlayın ve etiketlendi. Bir gres kalemi ile çapı ~ 1 cm bir halka çizin ve yağ kuru izin. 1x Krebs tamponu hazırlayın, pH 7.8 (Tablo 1). 2,5−2,8 adımlarını önceden ısıtmak için 50 mL 1x Krebs ile 34 °C arasında iki konik tüp koyun. 1x Krebs’in geri kalanını 4 °C’de veya buzüzerinde saklayın. BSA çözümleri hazırlayın. Önce 1x Krebs tamponunda 2,5 g BSA eriterek Krebs’te (w/v) BSA çözeltisinin 25 mL’sini 25 mL’lik son hacmine kadar hazırlayın. Farklı BSA konsantrasyonları elde etmek için ‘lu BSA çözeltisini 1x Krebs tamponuyla seyreltin(Tablo 2). Tüm BSA çözeltilerini 4 °C’de saklayın.NOT: İşlemin olduğu gün çözeltiler hazırlayın ve kullanıma kadar 4 °C’de saklayın. Doğru miktarda tripsin ve kollajenaz miktarını 50 mL konik tüplere tartarak sindirim enzimlerini hazırlayın(Tablo 3). 2. Hayvan Diseksiyonu ve Germ Hücre Süspansiyonhazırlanması NOT: Bu tamamlamak için yaklaşık 1 saat sürer. Servikal çıkık veya CO2 boğulma yoluyla yetişkin bir erkek fareyi (7 hafta veya daha büyük, testis 80−120 mg ağırlığında, sınma ve yaşa bağlı olarak) kurban edin. % 70 etanol ile farenin ventral karın sprey. Abdominopelvik boşluğu makasla açarak V şeklinde bir açıklık haline getirin. Forceps ile epididymal yağ yastığı çekerek, testisler bulmak ve makas ile kaldırın. Tunica albuginea rahatsız kaçının. Testisleri 1x Krebs içeren 6 cm’lik petri kabına yerleştirin. Testisleri dekapsulate ve tunica albuginea atın. Seminiferous tübülleri, forcep’lerle hafifçe alay ederek hafifçe dağıtın. Seminiferous tübülleri 2 mL taze hazırlanmış kollajenaz çözeltisi içeren 50 mL konik bir tüpe aktarmak için forseps kullanın(Tablo 3). 37 °C’lik su banyosundaki tübülleri 3 dk. tüpü sallayarak hafifçe çalkalayın.NOT: Serbestçe yüzen tübüller interstisyel hücrelerin kaldırılması nedeniyle 3 dakika içinde oluşmalıdır. Testis hücrelerinin fizyolojik sıcaklığı 34 °C’dir; bu nedenle, uzun sindirim genellikle bu sıcaklıkta yapılır. Ancak, kısa 3 dk sindirim 37 °C (üretici tarafından önerilen sıcaklık) yapılabilir. 34 °C kullanılırsa, sindirim süresinin yeniden optimize edilmesi gerektiğini unutmayın. En az 40 mL sıcak 1x Krebs ekleyin ve tübüllerin oda sıcaklığında (RT) tortu (~1 dk) olmasını bekleyin. Supernatant çıkarın ve 1x tekrarlayın. 25 mL taze hazırlanmış tripsin çözeltisi(Tablo 3),tüpü 34 °C inkübatörün içine tüp rotatörüne yerleştirin ve 15−20 dakika (~15 rpm) kuluçkaya yatırın. Düzensiz tübüllerin durumunu kontrol edin. Çözüm bulutlu hale geldikten sonra ve sadece küçük tübül parçaları kaldı, tüpü buza yerleştirin ve hemen bir sonraki adıma geçin.NOT: Aşırı hazımsızlık ve hücre lisisinden kaçınmak için, hızla aşağıdaki yıkama adımlarına geçin. Bazı protokoller fetal sığır serumu (FBS) ile tripsin inaktive sini içerir. Bu protokolde, FBS tedavisi atlanır ve bunun yerine, tripsin hemen santrifüj ve soğuk 1x Krebs ile sonraki yıkar tarafından kaldırılır. Çözeltiyi 40 m’lik hücresüzden buz üzerinde yeni bir 50 mL konik tüpe filtreleyin. 4 °C’de 5 dk için 600 x g santrifüj ve hücreler.NOT: Çok güçlü bir kuvvetle santrifüj hücrelere zarar verebilir. Dikkatle dışarı dökerek supernatant çıkarın. 1x Krebs geri kalanında hücreleri yeniden askıya almak için hücre pelet dokunun. Resuspended hücrelere en az 40 mL soğuk 1x Krebs ekleyin. Adımları 2.10 ve 2.11’i yineleyin. Hücreleri yeniden askıya almak için hücre peletile tüp dokunun. 1x Krebs’e %0,5 BSA 1 mL ekleyin ve kesme pipet ucu yla çözeltiyi yukarı ve aşağı boruhaline vererek hücreleri yeniden askıya alın. Kabarcıklar yapmaktan kaçının. Son olarak, son hacmi ~3 mL olacak şekilde 1x Krebs’e %0,5 BSA’dan 1−3 mL ekleyin. 40 μm hücreli süzgeç aracılığıyla germ hücre süspansiyon filtrate ve BSA gradyan hücreleri yükleme ye hemen devam edin. 3. Kesintili BSA Gradyan Yoluyla Germ Hücrelerinin Ayrılması NOT: Bu bölümün tamamlanması yaklaşık 2 saat sürer. Yıkama adımları sırasında (adım 2.10−2.14) hücreleri ön işlem hazır olur olmaz yüklemek için sürekli bsa degradesini hazırlamaya başlayın. Tüpün bir tarafını görebilmeniz için 50 mL’lik bir tüpü dikey olarak buz üzerinde barındırın. Alternatif olarak, protokolü 4 °C’de soğuk bir odada çalıştırın, bu durumda buz gerekmez. 10 mL’lik serolojik pipetin ucunu ucundan yaklaşık 5−10 mm kesin ve daha büyük bir diyafram açıklığı elde edin(Şekil 1A), ve pipet denetleyicisine monte edin(Şekil 1C).NOT: Bu, farklı BSA çözümlerinin istifleme kolaylaştırır pipetleme sırasında hızını azaltacaktır. Alternatif olarak, pürüzsüz bir pistonlu 1 mL mekanik pipet kullanın ve pipet uçlarını yaklaşık 3 mm çapında diyafram açıklığıyla kesin(Şekil 1B). 50 mL borunun altına %5 BSA çözeltisi 5 mL boru ile başlayın. %5 çözeltinin üzerine %4 BSA çözeltisinin 5 mL’ini yavaşça pipet. Pipetin kesme ucu ile %5’lik çözeltinin yüzeyine hafifçe dokunarak başlayın ve iki çözeltiyi yüzeye dikkatlice tutarak pipet ucunun batırılmasını sağlamayın.NOT: Bu adımın sonunda iki katman arasında net bir çizgi görülmelidir. Diğer BSA çözümleriyle birlikte 3.4 adımını tekrarlayın %5’ten %1’e kadar kesintisiz bir degrade eldeedin (Şekil 1D). Tek hücreli süspansiyonu rahatsız etmeden degradenin üzerine dikkatlice yükleyin. Hücrelerin 4 °C’de veya buz üzerinde 1,5 saat boyunca degradeden geçirmelerini sağlar. 4. Zenginleştirilmiş Germ Hücre Fraksiyonları Koleksiyonu NOT: Bu bölümün tamamlanması yaklaşık 30 dakika sürer. 1 mL mekanik pipete üzerine 1 mL’lik bir pipet ucu monte edin ve diyafram açıklığı ~3 mm çapında olacak şekilde ucu kesin(Şekil 1B). BSA degradesinin üstünden başlayarak 1,5 mL’lik ayrı tüplerde ~1 mL kesirleri dikkatlice toplayın ve buzüzerinde saklayın. Tüpleri kesirlerle aynı sırada numaralandırın.NOT: Bu noktada, hücre süspansiyonları içeren ~ 28 tüpler bir dizi olmalıdır. Pürüzsüz bir pistonlu 1 mL mekanik pipet kullanın ve BSA degradesini bozma riskini en aza indirmek için pipet uçlarını kesin. 4 °C’de 10 dk için 600 x g’de germ hücre fraksiyonlarını santrifüj edin. Pelet rahatsız etmemeye dikkat edin, supernatant en atın ve tüp flicking hücre pelet resuspend. Her tüpe 1 mL buz gibi 1x Krebs tamponu ekleyin ve santrifüjü tekrarlayın.NOT: BSA akış aşağı analizine müdahale ederse yıkama adımını tekrarlayın. Supernatant çoğu atın ama son yıkamadan sonra ~ 100 μL bırakın. Hücre peletini dikkatlice yeniden askıya alın.NOT: Hücreleri dikkatle yeniden susulamak, bu çözeltiden alınan numunenin verilen fraksiyonun tüm hücrelerini temsil ettiğini garanti eder. Slaytları hazırlarken hücre süspansiyonlarını buzüzerinde tutun. 5. Hücre Kesirlerinin Analizi NOT: Analizin tamamlanması 2 saat sürer. Birer birer, pipet 20 μL 4% paraformaldehit (PFA) numaralanmış bir mikroskopslayt üzerinde her gres kalem halkası içinde. Hemen ilgili fraksiyondan resuspended hücre süspansiyon 2 μL ekleyin. Her kesir için tekrarlayın.NOT: Slaytları hazırlarken, tüm hücre süspansiyonlarını buzda tutun. Slaytları RT’de 1 saat ila bir gece (O/N) kurutun.NOT: Bu adımda, her fraksiyondan bir örnek alındıktan sonra, hücreler aşağı analizleri veya depolama için işlenebilir (bölüm 6). 1x PBS ile slaytlar bir kez durular ve 4’,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Malzeme Tablosuile montaj orta ile monte. Bir floresan mikroskobu altında slaytlar analiz belirli germ hücre tipi her fraksiyonu zenginleştirilmiş olduğunu tahmin etmek.NOT: Farklı hücre tipleri DAPI boyama ile görselleştirilmiş karakteristik nükleer morfolojisi ile tanınabilir. Şekil 2 Uzamış spermatitler, yuvarlak spermatitler ve pachytene spermatositlerle zenginleştirilmiş temsili fraksiyonlar gösterir. Yuvarlak spermatid çekirdeği küçük (çapı 6−7 μm) ve yuvarlaktır(Şekil 2A). Fare yuvarlak spermatid çekirdekleri de kromocenter denilen tek, yuvarlak heterokromatin yapısı ile karakterizedir. Uzamış spermatidlerin çekirdekleri tipik bir uzatılmış şekle ve kromatin yoğuşması nedeniyle nükleer boyutu azalmıştır(Şekil 2A). Pachytene spermatosit çekirdekleri çok daha büyük (çapı 10 μm’den fazla) ve daha düzensiz şekil, yoğun paketlenmiş kromatin alanları boyunca dağıtılan (Şekil 2A). Gerekirse, farklı hücre tiplerinin tanınmasını desteklemek için DAPI boyama ek olarak immünboyama gerçekleştirin. Bu durumda, bir gres kalemi halkasının içine 20 μL sabitleme çözeltisi (%4 PFA ve PBS’de %0,1 noniyonik yüzey aktif madde) ile 2 μL hücre süspansiyonu yayılır. Slaytlar kurutultuktan sonra hücreleri RT’de 10 dk boyunca %4 PFA ile düzeltin. PBS ile durulayın, sonra PBS’de %0.1 noniyonik yüzeyaktif madde ile 5 dk. PBS ile durulayın ve 100 mM NH4Cl’de slaytları 5 dk boyunca kuluçkaya yatırarak kalan PFA’ları etkisiz hale getirin. PBS ile durulanın ve spesifik primer antikorlar ve florokrom etiketli ikincil antikorlarla bloke ve kuluçkalardan oluşan standart bir immünorfloresan protokolüne devam edin. Slaytları DAPI(Malzeme Tablosu)ile antifade montaj antile monte edin ve 24 saat boyunca ayarlamalarını bekleyin.NOT: Primer antikor inkübasyonları için yararlı belirteçlere örnek olarak, akrozomu yuvarlak ve uzamış spermatidler, anti-DDX4 antikorları (blokaj çözeltisinde 1:200) tek bir etiketle lekeleyen yer fıstığı agglutinin (PNA; 1:2,000 bloklama çözeltisinde) verilebilir. yuvarlak spermatidlerde sitoplazmik granül ve pachyten spermatositlerde cinsiyet bedenlerini tanıyan anti-γH2AX antikor (blokaj çözeltisinde 1:100). Kesirlerin immünoresans analizi örnekleri için temsili sonuçlara ve Şekil 2C,D’ye bakın. 6. Depolama Için Kalan Numunelerin İşlenmesi NOT: Bölüm 6 tamamlamak için yaklaşık 20 dakika sürer. Her bir kesirden bir numune alındıktan sonra, her fraksiyona 1 mL buz gibi 1x Kreb ekleyin ve hücreleri 4 °C’de 10 dakika boyunca 600−13.000 x g’de santrifüj edin.NOT: Düşük hızlı santrifüj gevşek bir pelet ile sonuçlanır, bu da 1x Krebs’in tamamen çıkarılmasını zorlaştırırken, yüksek hızlı bir santrifüj hücrelere zarar verebilir. Downstream protokolünün belirli gereksinimlerine göre santrifüj hızını seçin. Supernatant’ı çıkarın ve atın ve tercih edilen akış aşağı analizine devam edin.NOT: Bu noktada hücreler sıvı nitrojende dondurulabilir ve -70 °C’de depolanabilir. Bir kez bu tekniği aşina, doğrudan tercih downstream protokolü ile devam etmek mümkündür, ama her zaman bir örnek almak ve her kesir saflığını sağlamak için tavsiye edilir. Toplam RNA ayıklanabilir, ölçülebilir ve ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve RNA sıralama gibi yöntemlerle analiz edilebilir. Total protein özleri de hangi immünopresipitasyon veya batı lekeleme analizi yapılabilir(Şekil 3)hazırlanabilir.