標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

実験マウスおよびすべての実験の維持は、実験動物のケアおよび使用に関する関連ガイドラインおよび規則に従って行われた。 1. 機器・試薬のセットアップ 水風呂を37°Cに設定します。 細胞培養インキュベーターを34°C、5%CO2、95%の湿度に設定します。チューブローターをインキュベーターの中に入れます。注:インキュベーターは内部温度を変えるために長い時間を必要とする。インキュベーターが常に34°Cに設定されていない場合は、実験の1日前に1つを設定します。 顕微鏡ガラススライドの適切な量を準備し、ラベルを付けます。グリースペンで直径約1cmのリングを描き、グリースを乾かします。 1xクレブスバッファ、pH 7.8(表1)を準備します。ステップ2.5−2.8のために予め暖めるために1x Krebsの50 mLの2つの円錐形の管を34 °Cに置く。残りの1xクレブスを4°Cまたは氷の上に保管してください。 BSA ソリューションを準備します。まず、1x Krebsバッファで2.5gのBSAを25mLの最終容積に溶解することにより、クレブスで10%(w/v)BSA溶液の25 mLを調出します。1x Krebsバッファーで10%BSA溶液を希釈し、異なるBSA濃度を得る(表2)。すべての BSA ソリューションを 4 °C に保ちます。注:手順の同じ日に溶液を準備し、使用するまで4°Cで保存します。 トリプシンとコラゲナーゼの正しい量を50mL円錐管に計量して消化酵素を調製する(表3)。 2. 生殖細胞懸濁液の動物解剖と調製 注:完了までに約 1 時間かかります。 成体の雄マウス(7歳以上、精巣は、子宮頸部脱臼またはCO2窒息を介して80−120mgの重量を量る)を犠牲にする。 70%のエタノールでマウスの腹部腹部をスプレーします。はさみを使って腹部の空洞を開き、V字型の開口部を作ります。 鉗子で精巣の脂肪パッドを引っ張って、精巣を見つけ、はさみでそれらを取り除きます。チュニカアルブギネアを邪魔しないでください。1xクレブスを含む6 cmペトリ皿に精巣を置きます。 精巣を解凍し、チュニカアルブギネアを廃棄します。鉗子でそれらをそっと引き離すことによって、わずかに半精細管を分散させる。 鉗子を使用して、新たに調製されたコラゲナーゼ溶液の2 mLを含む50 mL円錐管に半精管を移す(表3)。 37°Cの水浴で管を3分間インキュベートし、チューブを揺らして優しく攪拌します。注:自由に浮遊する管は間質細胞の除去のために3分以内に起こるべきである。精巣細胞の生理的温度は34 °C;したがって、長い消化は通常、この温度で行われます。しかし、短い3分の消化は37 °C(製造業者によって推奨される温度)で行うことができる。34 °Cを使用する場合は、消化時間を再最適化する必要があります。 暖かい1xクレブの少なくとも40 mLを追加し、室温(RT)で沈砂(〜1分)に管を許可します。上清を取り出し、1xを繰り返します。 作りたてのトリプシン溶液(表3)の25 mLを加え、34°Cインキュベーター内のチューブ回転子にチューブを置き、15−20分(〜15rpm)インキュベートします。散発的に管の状態を確認します。溶液が曇り、小さなチューブだけが残ったら、チューブを氷の上に置き、すぐに次のステップに進みます。注:過消化と細胞リシスを避けるために、次の洗浄手順に迅速に移動します。いくつかのプロトコルは、胎児ウシ血清(FBS)によるトリプシンの不活性化を含む。このプロトコルでは、FBS治療は省略され、代わりに、トリプシンは即時遠心分離によって除去され、その後の冷たい1xクレブで洗う。 40 μmセルストレーナーを通して溶液を氷上の新しい50 mL円錐管に濾過します。 遠心分離機600 x gを4°Cで5分間ペレットする。注:力が強すぎると遠心分離が細胞に害を与える可能性があります。 慎重に注いで上清を取り除きます。 セルペレットをタップして、1xクレブスの残りの部分で細胞を再中断します。 再懸濁した細胞に少なくとも40 mLの冷たい1xクレブスを加える。 手順 2.10 と 2.11 を繰り返します。 細胞ペレットでチューブをタップして、細胞を再サスペンドします。1xクレブスに0.5%BSAの1 mLを追加し、カットピペット先端で溶液を上下にピペッティングしてセルを再中断します。気泡を作ることを避けてください。 最後に、最終容積が~3 mL になるように、1x クレブスに 0.5% BSA の 1−3 mL を追加します。40 μmセルストレーナーを介して生殖細胞懸濁液を濾過し、BSA勾配に細胞をロードするために直ちに進みます。 3. 不連続BSA勾配による生殖細胞の分離 注:このセクションが完了するまでに約 2 時間かかります。洗浄ステップ(ステップ2.10−2.14)中に不連続なBSA勾配の準備を開始し、前処理の準備が整い次第、細胞をロードします。 チューブの片側を見ることができるように、氷の上に垂直に50 mLチューブを収容します。または、4 °Cのコールドルームでプロトコルを実行し、その場合は氷は必要ありません。 先端から10mLの血清ピペットの先端を約5−10mm切り取り、より大きな絞りを得る(図1A)、ピペットコントローラ(図1C)に取り付けます。注:これにより、ピペッティング中の速度が低下し、さまざまな BSA ソリューションの積み重ねが容易になります。または、滑らかなピストンを持つ1 mLの機械ピペットを使用し、直径約3mmの開口部でピペットの先端を切断します(図1B)。 50 mLチューブの底部に5%BSA溶液の5 mLをピペッティングから始めます。 5%溶液の上に4%BSA溶液の5 mLをゆっくりとピプトする。ピペットのカット先端で5%溶液の表面に優しく触れ、2つの溶液を重ね、慎重に表面との接触を維持し、ピペットの先端が浸漬しないようにします。注:この手順の最後に、2 つのレイヤー間に明確な線が表示される必要があります。 他の BSA ソリューションと共にステップ 3.4 を繰り返し、5% から 1% までの不連続な勾配を得ます (図 1D)。 グラデーションの上に、邪魔することなく、単一セルサスペンションを慎重にロードします。4°Cまたは氷の上で1.5時間の勾配を通して細胞を堆積させてください。 4. 濃縮生殖細胞画分の収集 注:このセクションの所要時間は約 30 分です。 1 mL ピペット先端を 1 mL のメカニカル ピペットに取り付け、開口部が直径約 3 mm であるように先端を切ります (図 1B)。 BSA勾配の上から始まる別々の1.5 mLチューブに~1mL分画を慎重に収集し、氷の上に保管します。分数と同じ順序でチューブに番号を付けます。注:この時点で、細胞懸濁液を含む一連の〜28本のチューブが存在する必要があります。滑らかなピストンと1 mLの機械ピペットを使用し、BSAの勾配を乱すリスクを最小限に抑えるためにピペットの先端をカットします。 生殖細胞の画分を600xgで遠心分離し、4°Cで10分間使用します。 ペレットを邪魔しないように注意し、上清のほとんどを廃棄し、チューブをフリックして細胞ペレットを再懸濁させます。各チューブに1mLの氷冷1xクレブスバッファを追加し、遠心分離を繰り返します。注:BSA がダウンストリーム解析に干渉する場合は、洗浄手順を繰り返します。 上清の大部分を廃棄するが、最終洗浄後に~100μLを残す。細胞ペレットを慎重に再中断します。注:細胞を慎重に再中断すると、この溶液から採取されたサンプルが与えられた分数のすべてのセルを表していることを確認します。スライドを準備しながら、氷の上にセルサスペンションを保持します。 5. 細胞画分の解析 注:分析が完了するまでに 2 時間かかります。 一度に1つずつ、番号付き顕微鏡スライド上の各グリースペンリング内に4%パラホルムアルデヒド(PFA)のピペ20 μLを含む。 直ちに、対応する分画から再懸濁した細胞懸濁液の2 μLを加える。分数ごとに繰り返します。注:スライドの準備中は、すべてのセルサスペンションを氷の上に保管してください。 RTでスライドを1時間から一晩(O/N)乾燥させます。注:このステップでは、各画分からサンプルを採取した後、セルをダウンストリーム分析または保存用に処理することができます(セクション6)。 スライドを1x PBSで一度すすいで、4′,6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)(材料の表)で取り付け媒体で取り付けます。 蛍光顕微鏡下のスライドを分析し、各画分でどの特定の生殖細胞タイプが濃縮されているかを推定します。注:異なる細胞型は、DAPI染色によって可視化された特徴的な核形態によって認識することができる。図 2Aは、細長い精子、丸精子およびパチテン精子細胞で濃縮された代表的な分画を示す。丸い精子核は小さく(直径6~7μm)、丸い(図2A)。マウス丸精子核はまた、クロモセンターと呼ばれる単一の丸いヘテロクロマチン構造によって特徴付される。細長い精子の核は、典型的な細長い形状を持ち、クロマチン凝縮による核サイズの減少を示す(図2A)。パチテン精子細胞核は、はるかに大きく(直径10μm以上)、より不規則な形状であり、密に詰められたクロマチンの領域が全体に分布している(図2A)。 必要に応じて、異なる細胞型の認識をサポートするためにDAPI染色に加えて免疫染色を行う。 この場合、グリースペンリング内に固定液(PBSでは4%PFAおよび0.1%のニオニオン界面活性剤)の20μLで2μLの細胞懸濁液を広げます。スライドを乾燥させた後、RTで10分間4%のPFAで細胞を接頭辞を付けた。 PBSですすし、次いでPBSで0.1%のニオニオニック界面活性剤を5分間透過し、100 mM NH4Clでスライドを5分間インキュベートして残りのPFAを無効にする。 PBSですすいで、特定の一次抗体およびフルオロクロム標識二次抗体によるブロッキングおよびインキュベーションからなる標準的な免疫蛍光プロトコルに進みます。DAPI(材料の表)でアンチフェードマウントでスライドをマウントし、24時間に設定することができます。注:一次抗体インキュベーションに有用なマーカーの例としては、アクロソームを丸く細長い精子で染色するピーナッツアグルチニン(PNA;ブロッキング溶液中の1:2,000)、単一の標識を付加する抗DDX4抗体(ブロッキング溶液中の1:200)が挙まれる。丸精子中の細胞質顆粒、およびパチテン精子細胞内の性体を認識する抗γH2AX抗体(ブロッキング溶液中1:100)。分画の免疫蛍光分析の例については、代表的な結果と図2C,Dを参照してください。 6. ストレージの残りのサンプルの処理 注:セクション6は完了までに約20分かかります。 各画分のサンプルを顕微鏡スライド用に採取したら、各画分に1mLの氷冷1x Krebsを加え、細胞を600−13,000 x gで10分間遠心分離し、4°Cで10分間使用します。注:低速遠心分離は緩いペレットを生み出し、1x Krebsを完全に除去することは困難ですが、高速遠心分離は細胞に害を与える可能性があります。ダウンストリーム プロトコルの特定の要件に従って遠心分離速度を選択します。 上清を取り除いて廃棄し、優先する下流分析を続けます。注:この時点で、細胞は液体窒素中でスナップ冷凍し、-70°Cで保存することができます。この技術に慣れたら、直接好みの下流プロトコルを続行することは可能ですが、常にサンプルを採取し、各画分の純度を確保することをお勧めします。全RNAは、逆転写性ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびRNAシーケンシングなどの方法によって抽出、定量、および分析することができる。全タンパク質抽出物は、免疫沈殿またはウェスタンブロッティング分析を行うことができるから調製することもできる(図3)。