העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

תחזוקת עכברי מעבדה וכל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים. 1. ציוד והגדרת מגיב הגדר את אמבטיית המים ל-37 ° c. הגדר את החממה לתרבות התא עד 34 ° c, 5% CO2, 95% לחות. שים את מסובבי הצינור. בתוך החממההערה: החממות דורשות זמן רב לשנות את הטמפרטורה הפנימית. אם חממה שנקבעה באופן קבוע ב-34 ° c אינה זמינה, הגדר אחת ליום לפני הניסוי. הכן ותייג את הכמות המתאימה של מגלשות זכוכית מיקרוסקופית. צייר טבעת של ~ 1 ס מ קוטר עם עט גריז ולתת את השומן יבש. הכינו מאגר קרבס של 1x, pH 7.8 (טבלה 1). שימו שתי שפופרות חרוט עם 50 mL של 1x קרבס כדי 34 ° צ’ כדי לחמם מראש עבור שלבים 2.5-2.8. אחסן את שאר ה-1x קרבס ב-4 ° צלזיוס או על קרח. הכן פתרונות BSA. ראשית להכין 25 מ ל של 10% (w/v) פתרון BSA ב Krebs על ידי המסת 2.5 g של BSA ב-1x קרבס מאגר לנפח הסופי של 25 מ ל. לדלל את 10% הפתרון BSA עם מאגר בגודל 1x קרבס כדי להשיג ריכוזי BSA שונים (טבלה 2). שמור את כל פתרונות ה-BSA ב-4 ° c.הערה: הכינו פתרונות באותו יום של ההליך והחנות ב-4 ° צ’ עד השימוש. הכינו את אנזימי העיכול באמצעות שקילה על כמות הטריפסין הנכונה והקולגנאז ל-50 מ”ל צינורות חרוטי (שולחן 3). 2. בעלי חיים והכנת הבולם של תא נבט הערה: . זה לוקח בערך 1 שעות להשלים להקריב עכבר זכר מבוגר (בגיל 7 שבועות או מעלה, ביקורות ששוקל 80 ל 120 מ”ג בהתאם למתח ולגיל) דרך נקע בצוואר הרחם או שיתוף2 חנק. לרסס את הבטן הגחוני של העכבר עם 70% אתנול. פתח את חלל הבטן האופטית באמצעות מספריים, ביצוע פתיחה בצורת V. משיכת משטח שומן אפידימל עם מלקחיים, לאתר את האשכים ולהסיר אותם עם מספריים. הימנע מהפרעה אלבומין המנהרה. מניחים את האשכים על צלחת פטרי 6 ס”מ המכיל 1x קרבס. עריפת ראש האשכים ולהשליך את אלבומין המנהרה. קצת לפזר את tubules הסולת על ידי להקניט אותם בעדינות לגזרים עם מלקחיים. מלקחיים להשתמש כדי להעביר את tubules הסולת לתוך צינור 50 mL מכיל 2 מ ל של הפתרון המוכן טרי התמיסה (שולחן 3). מודטה את הטובולים באמבט המים 37 ° c במשך 3 דקות.. מתפרעים בעדינות על ידי הנדנדההערה: Tubules צף חופשי צריך להתרחש בתוך 3 דקות עקב הסרת תאים ביניים. הטמפרטורה הפיזיולוגית לתאי האשכים היא 34 ° c; לכן, לעיכול ארוך נעשים בדרך כלל בטמפרטורה זו. עם זאת, ניתן לנהל את העיכול הקצר 3 דקות ב37 ° צ’ (הטמפ ‘ המומלצת על ידי היצרן). שימו לב כי אם משתמשים ב-34 ° c, יש למטב מחדש את זמן העיכול. הוסף לפחות 40 mL של חם 1x Krebs ולאפשר tubules לשקע (~ 1 דקות) בטמפרטורת החדר (RT). הסר את הסופרנטאנט וחזור על 1x. הוסיפו 25 מ ל של פתרון טריפסין טרי (שולחן 3), הניחו את הצינור על מסובבי הצינור בתוך החממה 34 ° c, ו-הדגירה עבור 15-20 דקות (~ 15 סל ד). . בדיקת הנבגים במצב של הטובולים לאחר הפתרון הופך מעונן ורק חתיכות קטנות של tubules להישאר, למקם את הצינור על הקרח ומיד להמשיך לשלב הבא.הערה: כדי להימנע מעיכול יתר ומפירוק תאים, הזז במהירות לשלבי הכביסה הבאים. פרוטוקולים מסוימים כוללים את הביטול של טריפסין על ידי סרום של שור עוברי (FBS). בפרוטוקול זה, טיפול FBS מושמט, ובמקום זאת, טריפסין מוסר על ידי צנטריפוגה מיידית ושוטף הבאים עם קר 1x Krebs. לסנן את הפתרון באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר לתוך צינור חדש 50 mL חרוט על קרח. צנטריפוגה 600 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ’ כדי גלולה התאים.הערה: צנטריפוגה עם כוח חזק מדי עלול להזיק לתאים. הסר את הסופרנטנט על ידי שפיכת החוצה בזהירות. הקש על הגלולה הסלולרית כדי להשעות את התאים בשארית של 1x Krebs. הוסף לפחות 40 mL של קר 1x קרבס לתאים מושעה מחדש. חזור על שלבים 2.10 ו-2.11. הקש על השפופרת עם הגלולה כדי להשעות מחדש את התאים. הוסף 1 מ ל של 0.5% BSA ב 1x קרבס ובעזרת פיפטה חיתוך מחדש את התאים על ידי ליטוף הפתרון למעלה ולמטה. להימנע מעשיית בועות. לבסוף, הוסף 1 ל-3 מ”ל של 0.5% BSA ב-1x Krebs כך שאמצעי האחסון הסופי הוא ~ 3 mL. Filtrate תא הנבט השעיה דרך מסננת תא 40 יקרומטר ולהמשיך מיד כדי לטעון את התאים על מעבר הצבע bsa. 3. הפרדת תאי הנבט באמצעות הדרגה הרציפה של BSA הערה: סעיף זה לוקח בערך 2 h כדי להשלים. התחל להכין את מעבר הצבע הקטוע של BSA במהלך שלבי הכביסה (השלבים 2.10-2.14) כדי לטעון את התאים ברגע שהטיפול הקדם מוכן. להתאים שפופרת 50 mL אנכית על הקרח, כך שניתן לראות צד אחד של הצינור. לחלופין, הפעל את הפרוטוקול בחדר קר ב-4 ° c, ובמקרה זה אין צורך בקרח. חותכים את הקצה של הצינורות בגודל 10 מ”ל בערך 5-10 מ”מ מהקצה כדי להשיג צמצם גדול יותר (איור 1א), ומהר אותו על בקר הפיפטה (איור 1ג).הערה: זה יהיה להקטין את המהירות במהלך ליטוף, אשר מקלה על הערמה של פתרונות BSA שונים. לחילופין, השתמש בפיפטה מכני אחד מ-mL עם בוכנה חלקה וגזור את עצות הפיפטה עם צמצם של כ -3 מ”מ קוטר (איור 1B). התחל על ידי ליטוף 5 מ ל של 5% הפתרון BSA בתחתית הצינור 50 mL. באופן איטי pipet 5 מ”ל של 4% BSA הפתרון על גבי הפתרון 5%. התחל על ידי נגיעה עדינה על פני השטח של הפתרון 5% עם קצהו החתוך של הפיפטה ושכבה את שני הפתרונות תוך שמירה קפדנית על מגע עם פני השטח, ומבטיחים שלא לאפשר את הטיפ הפיפט להיות שקוע.הערה: קו ברור צריך להיות גלוי בין שתי השכבות בסוף שלב זה. חזור על שלב 3.4 עם פתרונות ה-BSA האחרים לקבלת מעבר הדרגתי לא רציף מ-5% עד 1% (איור 1D). טען בזהירות את ההשעיה של התא היחיד מעל מעבר הצבע מבלי להפריע. תן התאים משקע דרך הדרגתי עבור 1.5 h ב 4 ° צ’ או על קרח. 4. אוסף של שברים של תא נבט מועשר הערה: סעיף זה לוקח בערך 30 דקות כדי להשלים. הר a 1 מ ל מעלה לתוך הצנרת מכני 1 mL וחותכים את הקצה כך הצמצם הוא ~ 3 מ”מ קוטר (איור 1B). בזהירות לאסוף ~ 1 שברי mL ב 1.5 הנפרדים צינורות mL, החל מראש הדרגתי של BSA, ולאחסן אותם על הקרח. מספר את הצינורות באותו סדר כמו השברים ייאספו.הערה: בשלב זה, צריך להיות סדרה של ~ 28 צינורות המכילים השעיות תא. השתמש בפיפטה מכני 1 mL עם בוכנה חלקה וחותכים את עצות הפיפטה כדי למזער את הסיכון להפריע למעבר הצבע BSA. צנטריפוגה את שברי תא הנבט ב 600 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. להיזהר לא להפריע את הגלולה, להשליך את רוב supernatant ולהשעות את הגלולה התא על ידי מצליף בצינור. הוסף 1 מ ל של מאגר הקרח קר 1x קרבס לכל צינור וחזור על צנטריפוגה.הערה: חזור על צעד הכביסה אם BSA מפריעה לניתוח במורד הזרם. למחוק את רוב supernatant אבל לעזוב ~ 100 μL לאחר השטיפה האחרונה. . השהה מחדש את הגלולה בזהירותהערה: השעיית התאים מחדש בזהירות מבטיחה שהמדגם שנלקח מפתרון זה מייצג את כל התאים של השבר הנתון. השאר את השפני התאים על הקרח בזמן הכנת השקופיות. 5. ניתוח שברים של תאים הערה: . הניתוח לוקח 2 שעות להשלים אחד בכל פעם, pipet 20 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) בתוך כל טבעת משחה העט על שקופית מיקרוסקופ ממוספרים. הוסף מיד 2 μL של השעיית תא מחדש מהשבר המקביל. חזור על הפעולה עבור כל שבר.הערה: בעת הכנת שקופיות, השאר את כל השעיות התאים על הקרח. יבש את השקופיות בשעה RT עבור 1 h עד לילה (O/N).הערה: במהלך שלב זה, לאחר נטילת דגימה מכל שבר, ניתן לעבד את התאים עבור ניתוח או אחסון במורד הזרם (סעיף 6). לשטוף את השקופיות פעם עם 1x PBS ו הר עם הרכבה בינונית עם 4 ′, 6-diamidino-2-פנילילינדול (DAPI) (שולחן החומרים). לנתח את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי להעריך איזה סוג תא הנבט מסוים מועשר בכל שבר.הערה: סוגי תאים שונים ניתן לזהות על ידי המבנה הגרעיני האופייני שלהם דמיינו על ידי כתמים DAPI. איור 2 מראה שברים נציג מועשר להאריך spermatids, מעגלי הזרע והספרציטים pachytene. גרעין הזרע העגול קטן (6-7 יקרומטר בקוטר) ועגול (איור 2א). העכבר מסביב גרעיני spermatid מאופיינים גם על ידי יחיד, עגול הטרוכרומטין מבנה הנקרא כרומוסנטר. גרעינים של להאריך spermatids יש צורה מוארך טיפוסי מופחתת גודל גרעיני עקב עיבוי כרומטין (איור 2א). גרעיני הספרטין הם הרבה יותר גדולים (קוטר יותר מ -10 μm) ויותר לא סדיר בצורה, עם אזורים של כרומטותין בצפיפות צפופה המופצים בכל רחבי (איור 2א). במקרה הצורך, בצע כתמים מסוג חיסוני בנוסף לצביעת DAPI כדי לתמוך בזיהוי סוגי התאים השונים. במקרה זה, להפיץ 2 μL של ההשעיה של התא עם 20 μL של פתרון תיקון (4% בתחתית ו 0.1% nonionic החומר ב-PBS) בתוך טבעת משחה העט. לאחר ייבוש השקופיות, postfix את התאים עם 4% כלפי מע עבור 10 דקות ב RT. לשטוף עם PBS, ולאחר מכן החדיר עם 0.1% nonionic חומרים פעילי שטח ב-PBS עבור 5 דקות. לשטוף עם PBS ולבטל את כל השאר בתוך האלבום האחרון על ידי מגלשות שקופיות ב 100 mM NH4Cl עבור 5 דקות. לשטוף עם PBS ולהמשיך לפרוטוקול אימונוofluorooooooooov, המורכב מחסימת וincubations עם נוגדנים עיקריים ונוגדנים משני בעלי תוויות פלואורואוכרום. הר את השקופיות עם מפעיל לדעוך עם DAPI (טבלת חומרים) ולאפשר להם להגדיר עבור 24 h.הערה: דוגמאות של סמנים שימושיים עבור נוגדנים הראשי incubations כוללים בוטנים ציטינטין (הרשות הפלסטינית; 1:2000 בפתרון חסימה) כי כתמי אקרוכמה בסיבוב ו להאריך spermatids, אנטי DDX4 נוגדן (1:200 בפתרון חסימה) כי תוויות יחיד cytoplasmic הגרניט בתוך spermatids עגול, אנטי γH2AX נוגדן (1:100 בפתרון חסימה) כי מזהה את גופי המין בספרציטים pachytene. עיין בתוצאות הנציגים ובאיור 2ג, ד לקבלת דוגמאות של ניתוח אימונוoforc של השברים. 6. עיבוד הדגימות הנותרות לאחסון הערה: סעיף 6 לוקח כ 20 דקות להשלים. לאחר מדגם מכל שבר נלקח לשקופית מיקרוסקופ, להוסיף 1 מ ל של קרח קר 1x קרבס לכל שבר ו צנטריפוגה את התאים למטה ב 600 ל13000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.הערה: מהירות נמוכה צנטריפוגה תוצאות בגלולה רופף, מה שמקשה להסיר לחלוטין 1x Krebs, בעוד צנטריפוגה במהירות גבוהה עלול לפגוע בתאים. בחר את מהירות הצנטריפוגה בהתאם לדרישות הספציפיות של פרוטוקול הזרם. להסיר ולמחוק את הסופרנטאנט ולהמשיך בניתוח מועדף במורד הזרם.הערה: בשלב זה, התאים יכולים להיות מוקפאים בחנקן נוזלי ומאוחסנים ב-70 ° c. לאחר היכרות עם טכניקה זו, ניתן להמשיך עם פרוטוקול במורד הזרם של העדפה ישירה, אבל תמיד מומלץ לקחת דגימה ולהבטיח את הטוהר של כל שבר. סך RNA ניתן לחילוץ, כימות ומנותח על-ידי שיטות כגון תגובת שרשרת של היפוך פולימראז (PCR) ורצפי RNA. תמציות חלבון סה כ יכולים גם להיות מוכנים שבהם ניתוח immunoprecipitation או מערבי ניתן לבצע (איור 3).