Verrijking van Pachyteen spermatocyten en spermatiden van muis testes met behulp van Standaard laboratoriumapparatuur

Het onderhoud van laboratorium muizen en alle experimenten werd uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. 1. uitrusting en reagens opstelling Stel het waterbad in op 37 °C. Zet de celkweek incubator op 34 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid. Plaats de buis Rotator in de incubator.Opmerking: Incubators vereisen een lange tijd om de interne temperatuur te veranderen. Als een incubator die constant op 34 °C is ingesteld niet beschikbaar is, stelt u één tot 1 dag voor het experiment in. Voorbereiding en etikettering van de juiste hoeveelheid microscopie glaasjes. Teken een ring van ~ 1 cm in diameter met een vetpen en laat het vet drogen. Bereid 1x Krebs buffer, pH 7,8 (tabel 1). Zet twee conische buisjes met 50 mL 1x Krebs tot 34 °C om voor de stappen 2.5 − 2.8 te verwarmen. Bewaar de rest van de 1x Krebs bij 4 °C of op ijs. Bereid BSA-oplossingen voor. Maak eerst 25 mL 10% (w/v) BSA-oplossing in Krebs door het oplossen van 2,5 g BSA in 1x Krebs-buffer tot een eindvolume van 25 mL. Verdun de 10% BSA-oplossing met 1x Krebs-buffer om verschillende BSA-concentraties te verkrijgen (tabel 2). Houd alle BSA-oplossingen bij 4 °C.Opmerking: Bereid oplossingen op dezelfde dag van de procedure en bewaar deze bij 4 °C tot het gebruik. Bereid de verteringsenzymen voor door de juiste hoeveelheid trypsine en collagenase te wegen tot 50 mL conische buisjes (tabel 3). 2. dierlijke dissectie en bereiding van de suspensie van kiemcellen Opmerking: Dit duurt ongeveer 1 uur om te voltooien. Offer een volwassen mannelijke muis (leeftijd 7 weken of ouder, Testis gewicht 80 − 120 mg afhankelijk van de stam en leeftijd) via cervicale dislocatie of CO2 asphyxiation. Spray de ventrale buik van de muis met 70% ethanol. Open de abdominopelvic-holte met een schaar en maak een V-vormige opening. Trekken op de epididymale Fat pad met Tang, lokaliseren van de teelballen en verwijder ze met een schaar. Vermijd het verstoren van het tunica albuginea. Leg de teelballen op een 6 cm Petri schaaltje met 1x Krebs. Decapsulate de teelballen en gooi het tunica albuginea. De seminifereuze tubuli lichtjes dispergeren door ze zachtjes te plagen met een tang. Gebruik de Tang voor het overbrengen van de seminifereuze tubuli in een conische buis van 50 mL met 2 mL vers bereide Collagenase oplossing (tabel 3). Inbroed de tubuli in het waterbad van 37 °C gedurende 3 min. agitate zachtjes door de buis te rocken.Opmerking: Vrij zwevende tubuli moeten binnen 3 min optreden als gevolg van het verwijderen van interstitiële cellen. De fysiologische temperatuur voor testiculaire cellen is 34 °C; Daarom worden lange digestons meestal gedaan bij deze temperatuur. De korte spijsvertering van 3 minuten kan echter worden uitgevoerd bij 37 °C (aanbevolen temperatuur door de fabrikant). Merk op dat als 34 °C wordt gebruikt, de verterings tijd opnieuw moet worden geoptimaliseerd. Voeg ten minste 40 mL warme 1x Krebs toe en laat de buisjes sediment (~ 1 min) bij kamertemperatuur (RT). Verwijder de supernatant en herhaal 1x. Voeg 25 mL vers bereide trypsine-oplossing (tabel 3) toe, plaats de buis op de buis Rotator in de 34 ° c-incubator en incuberen 15 − 20 min (~ 15 rpm). Controleer sporadisch de status van de tubuli. Zodra de oplossing troebel wordt en slechts kleine stukjes tubuli blijven, plaats de buis op ijs en ga onmiddellijk door naar de volgende stap.Opmerking: Om overspijs vertering en cellysis te voorkomen, beweegt u snel naar de volgende wasstappen. Sommige protocollen omvatten de deactivering van trypsine door foetaal runderserum (FBS). In dit protocol wordt de behandeling met FBS weggelaten, en in plaats daarvan wordt trypsine verwijderd door onmiddellijke centrifugeren en daaropvolgende wassingen met koude 1x Krebs. Filtreer de oplossing door een celzeef van 40 μm in een nieuwe conische buis van 50 mL op ijs. Centrifugeer 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c om de cellen te pellet.Opmerking: Centrifugeren met een te sterke kracht kan schadelijk zijn voor de cellen. Verwijder supernatant door het voorzichtig uit te gieten. Tik op de celpellet om de cellen in de rest van 1x Krebs te hervatten. Voeg ten minste 40 mL koude 1x Krebs toe aan de geresuspendeerde cellen. Herhaal de stappen 2,10 en 2,11. Tik op de buis met de celpellet om de cellen te hervatten. Voeg 1 mL 0,5% BSA toe in 1x Krebs en met een uitgesneden pipetpunt u de cellen hervatten door de oplossing op en neer te pipetteren. Vermijd het maken van bubbels. Voeg ten slotte 1 − 3 mL 0,5% BSA in 1x Krebs toe, zodat het uiteindelijke volume ~ 3 mL is. Filtraat de suspensie voor kiemcellen door een celzeef van 40 μm en ga onmiddellijk verder met het laden van de cellen op de BSA-gradiënt. 3. scheiding van kiemcellen door de discontinue BSA-gradiënt Opmerking: Deze sectie duurt ongeveer 2 uur om te voltooien. Begin met het voorbereiden van de discontinue BSA-gradiënt tijdens de wasstappen (stappen 2.10 − 2.14) om de cellen te laden zodra de voor behandeling klaar is. Plaats een buis van 50 mL verticaal op ijs zodat het mogelijk is om één kant van de buis te zien. U het protocol ook uitvoeren in een koude kamer bij 4 °C, in welk geval er geen ijs nodig is. Snijd de punt van een serologische Pipet van 10 mL ongeveer 5 − 10 mm van de punt om een groter diafragma (Figuur 1a) te verkrijgen en monteer het op de pipet controller (Figuur 1C).Opmerking: Dit zal de snelheid tijdens het pipetteren verminderen, wat het stapelen van de verschillende BSA-oplossingen vergemakkelijkt. U ook een mechanische Pipet van 1 mL met een gladde zuiger gebruiken en de pipetpunten knippen met een diafragma van ongeveer 3 mm in diameter (Figuur 1B). Begin met het pipetteren van 5 mL 5% BSA-oplossing naar de bodem van de 50 mL-buis. Pipet dan langzaam 5 mL 4% BSA-oplossing bovenop de 5%-oplossing. Begin met het zachtjes aanraken van het oppervlak van de 5%-oplossing met de snijpunt van de pipet en laag de twee oplossingen terwijl u het contact met het oppervlak zorgvuldig onderhoudt, zodat de pipetpunt niet kan worden ondergedompeld.Opmerking: Een duidelijke lijn moet zichtbaar zijn tussen de twee lagen aan het einde van deze stap. Herhaal stap 3,4 met de andere BSA-oplossingen krijgen een discontinu verloop van 5% tot 1% (Figuur 1D). Laad de eencellige suspensie voorzichtig bovenop de helling zonder te storen. Laat de cellen door de gradiënt sediment voor 1,5 h bij 4 °C of op ijs. 4. verzameling van verrijkte kiemcellen Opmerking: Deze sectie duurt ongeveer 30 minuten om te voltooien. Monteer een pipetpunt van 1 mL op een mechanische Pipet van 1 mL en snijd de punt zodanig dat het diafragma ~ 3 mm in diameter is (Figuur 1B). Verzamel voorzichtig ~ 1 mL fracties in afzonderlijke 1,5 mL buisjes, beginnend vanaf de bovenkant van de BSA gradiënt, en bewaar ze op ijs. Het aantal buisjes in dezelfde volgorde als de fracties worden verzameld.Opmerking: Op dit punt, moet er een reeks van ~ 28 buizen met cel suspensies. Gebruik een mechanische Pipet van 1 mL met een gladde zuiger en snijd de pipetpunten om het risico op verstoring van de BSA-gradiënt te minimaliseren. Centrifugeer de kiem fracties bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Wees voorzichtig om de pellet niet te storen, gooi het grootste deel van het supernatant weg en regeer de celpellet door de buis te flikken. Voeg 1 mL ijskoude 1x Krebs buffer toe aan elke buis en herhaal centrifugeren.Opmerking: Herhaal de wasstap als BSA interfereert met de downstream-analyse. Gooi het grootste deel van het supernatant weg, maar laat ~ 100 μL na de laatste wasbeurt. Respendeer de celpellet zorgvuldig.Opmerking: Door de cellen opnieuw op te schorten zorgt u ervoor dat het monster uit deze oplossing alle cellen van de opgegeven breuk vertegenwoordigt. Houd de celsuspensies op ijs tijdens het voorbereiden van de dia’s. 5. analyse van Celbreuken Opmerking: De analyse duurt 2 uur om te voltooien. Een voor een pipet keer 20 μL van 4% Paraformaldehyde (PFA) in elke vetpen ring op een genummerde microscopie dia. Voeg onmiddellijk 2 μL van de resuspendeerde celsuspensie uit de corresponderende Fractie toe. Herhaal dit voor elke breuk.Opmerking: Houd tijdens het voorbereiden van dia’s alle celsuspensies op ijs. Droog de glaasjes bij RT gedurende 1 uur tot ‘s nachts (O/N).Opmerking: Tijdens deze stap, na het nemen van een monster van elke fractie, kunnen de cellen worden verwerkt voor downstreamanalyses of opslag (sectie 6). Spoel de dia’s één keer met 1x PBS en monteer met een bevestigings medium met 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) (tabel van de materialen). Analyseer de dia’s onder een fluorescentiemicroscoop om te schatten welk type kiemcellen in elke fractie is verrijkt.Opmerking: Verschillende celtypen kunnen worden herkend door hun karakteristieke nucleaire morfologie, gevisualiseerd door DAPI-kleuring. Figuur 2 A toont representatieve fracties verrijkt met rek spermatiden, ronde spermatiden en pachyteen spermatocyten. De ronde spermatid Nucleus is klein (6 − 7 μm in diameter) en rond (Figuur 2A). Muis ronde spermatid kernen worden ook gekenmerkt door een enkele, ronde heterochromatide structuur genaamd de chromocenter. Nuclei van rek-spermatiden hebben een typische langwerpige vorm en een gereduceerde nucleaire grootte als gevolg van chromatine condensatie (Figuur 2a). Pachytene spermatocyt kernen zijn veel groter (diameter meer dan 10 μm) en meer onregelmatig in vorm, met gebieden van dicht verpakt chromatine verdeeld over de hele (Figuur 2A). Indien nodig, voert u naast de DAPI-kleuring ook immunokleuring uit ter ondersteuning van de herkenning van de verschillende celtypen. In dit geval, spreidt u 2 μl celsuspensie uit met 20 μl een bevestigingsoplossing (4% PFA en 0,1% nietionogene oppervlakteactieve stof in PBS) in een vetpen ring. Na het drogen van de dia’s, postfix de cellen met 4% PFA voor 10 min bij RT. Spoel met PBS, vervolgens permeabilize met 0,1% nonionische oppervlakteactieve stof in PBS gedurende 5 min. Spoel af met PBS en deactiveer eventuele resterende PFA door de glijbanen in 100 mM NH4cl gedurende 5 min. Spoel af met PBS en ga verder naar een standaard immunofluorescentie protocol dat bestaat uit blokkering en incubaties met specifieke primaire antilichamen en met fluor chroom gelabelde secundaire antilichamen. Monteer de dia’s met antifade inbedmiddel met DAPI (Inhoudsopgave) en laat ze voor 24 uur instellen.Opmerking: Voorbeelden van bruikbare markers voor primaire antilichaam incubaties zijn onder andere pinda agglutinines (PNA; 1:2000 in blokkerende oplossing) die de acrosome in ronde en rek bare spermatiden, anti-DDX4 antilichaam (1:200 in blokkerende oplossing) die een enkele cytoplasmatisch korrel in ronde spermatiden, en anti-γH2AX antilichaam (1:100 in blokkerende oplossing) die geslachtsorganen herkent in pachytene spermatocyten. Zie de representatieve resultaten en Figuur 2C, D voor voorbeelden van immunofluorescentie analyse van de fracties. 6. verwerking van de resterende monsters voor opslag Opmerking: Sectie 6 duurt ongeveer 20 minuten om te voltooien. Zodra een monster van elke fractie is genomen voor een microscopie dia, voeg 1 mL ijskoude 1x Krebs toe aan elke fractie en centrifugeer de cellen bij 600 − 13000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.Opmerking: Een lage-snelheid centrifugeren resulteert in een losse pellet, wat het moeilijk maakt om 1x Krebs volledig te verwijderen, terwijl een hogesnelheidcentrifugeren de cellen kan beschadigen. Kies de centrifugeersnelheid volgens de specifieke eisen van het downstream protocol. Verwijder en gooi het supernatant weg en ga verder met de voorkeur stroomafwaartse analyse.Opmerking: Op dit punt kunnen de cellen worden vastgevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij-70 °C. Eens bekend met deze techniek, is het mogelijk om direct door te gaan met het downstream Protocol van voorkeur, maar het is altijd aan te raden om een monster te nemen en de zuiverheid van elke fractie te waarborgen. Totaal RNA kan worden geëxtraheerd, gekwantificeerd en geanalyseerd volgens methoden zoals omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (PCR) en RNA-sequencing. Totaal eiwitextracten kunnen ook worden bereid waaruit immunoprecipitatie of westerse blotting analyse kan worden uitgevoerd (Figuur 3).