JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Konfokal Mikroskopi Ile Krallık Lararası Biyofilmlerde Hücre Dışı pH'ın izlenmesi

Published: January 30, 2020
doi:
10.3791/60270
,
1Department of Dentistry and Oral Health,Aarhus University

Summary

Protokol, Candida albicans ve Streptococcus mutans’tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerin ekimini açıklar ve bu biyofilmlerin içinde hücre dışı pH’ın izlenmesi için konfokal mikroskopi tabanlı bir yöntem sunar.

Abstract

Hem mantar hem de bakteri hücrelerinden oluşan krallıklar arası biyofilmler, endodontik enfeksiyonlar, periodontit, mukozal enfeksiyonlar ve en önemlisi erken çocukluk çürükleri gibi çeşitli ağız hastalıklarında rol oynarlar. Tüm bu koşullarda, biyofilm matrisindeki pH mikrop-konak etkileşimlerini ve dolayısıyla hastalığın ilerlemesini etkiler. Bu protokol, Candida albicans ve Streptococcus mutans’tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerdeki pH dinamiklerini izlemek için konfokal mikroskopi tabanlı bir yöntemi tanımlamaktadır. Biyofilmlerin hücre dışı bölgelerindeki pH düşüşlerini belirlemek için pH bağımlı çift emisyon spektrumu ve oranmetrik probu C-SNARF-4’ün boyama özellikleri nden yararlanılır. Prob ile pH oranlı metritrinin kullanımı, görüntüleme parametrelerinin titiz bir şekilde seçilmesi, boyanın ayrıntılı bir kalibrasyonu ve görüntü verilerinin dikkatli, eşik tabanlı post-processing’i gerektirir. Doğru kullanıldığında, teknik bir biyofilmin farklı alanlarında hücre dışı pH’ın hızlı bir şekilde değerlendirilmesini ve böylece zaman içinde hem yatay hem de dikey pH degradelerinin izlenmesini sağlar. Konfokal mikroskopi nin kullanımı Z-profillemi 75 μm veya daha az ince biyofilmlerle sınırlarken, pH ratiometrisi kullanımı krallıklar arası biyofilmlerde önemli bir virülans faktörünün noninvaziv çalışması için idealdir.

Introduction

Hem mantar hem de bakteri türlerini içeren krallıklar arası biyofilmler oral kavitede çeşitli patolojik koşullarda yer almaktadır. Candida spp. sıklıkla endodontikenfeksiyonlardan izole edilmiş 1 ve periodontal lezyonlardan2,3. Mukozal enfeksiyonlarda, mitis grubundan streptokok türleri mantar biyofilm oluşumunu geliştirmek için gösterilmiştir, doku invazyonu, ve hem in vitro hem de murine modelleri yayma4,5,6,7. En ilginci, Candida spp oral taşıma. çocuklarda çürük yaygınlığı ile ilişkili olduğu kanıtlanmıştır8. Kemirgen modellerinde gösterildiği gibi, Streptococcus mutans ve Candidas albicans arasında simbiyotik bir ilişki hücre dışı polisakkaritüretimini artırır ve kalın ve daha karojenik biyofilm oluşumuna yol açar9,10.

Yukarıda bahsedilen tüm koşullarda, özellikle erken çocukluk çürükleri, biyofilm pH hastalığın ilerlemesi için önemlidir, ve asitojenik mikroortamların geliştirilmesi için biyofilm matris in güzide rolü11 devletler çapraz krallık biyofilm içinde pH değişiklikleri incelenmesine olanak sağlayan metodolojiler için çağırır. Bakteriyel12 ve mantar13 biyofilm içinde pH izlemek için basit ve doğru konfokal mikroskopi tabanlı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Oranmetrik boya C-SNARF-4 ve eşik tabanlı görüntü işleme sonrası, hücre dışı pH bir biyofilm14her üç boyutta gerçek zamanlı olarak belirlenebilir. Biyofilmlerde mikroskopise dayalı pH izleme için yayınlanan diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, C-SNARF-4 ile pH oranlı metrisi basit ve ucuzdur, çünkü referans boya15 veya iki foton uyarma16içeren parçacık veya bileşiklerin sentezini gerektirmez. Sadece bir boya kullanımı prob bölümleme ile sorunları önler, floresan kanama-through, ve seçici ağartma16,17,18 hala hücre içi ve hücre dışı pH arasında güvenilir bir farklılaşma için izin verirken. Son olarak, boya ile kuluçka biyofilm büyüme sonra yapılır, hangi laboratuvar ve yerinde yetiştirilen biyofilmler hem de incelenmesine olanak sağlar.

Bu çalışmanın amacı, pH orantisi kullanımını genişletmek ve krallıklar arası biyofilmlerdeki pH değişikliklerini incelemek için bir yöntem sunmaktır. Kavram kanıtı olarak, yöntem glukoza maruz kalan S. mutanlar ve C. albicanlardan oluşan çift tür biyofilmlerinde pH’ı izlemek için kullanılır.

Protocol

Tükürük toplama protokolü Aarhus İlçesi Etik Komitesi (M-20100032) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. 1. Krallıklar Arası Biyofilmlerin Yetiştirilmesi Aerobik koşullarda 37 °C’de kan agar plakaları üzerinde S. mutans DSM 20523 ve C. albicans NCPF 3179 yetiştirin. Her organizmanın tek kolonilerini 5 mL beyin kalp infüzyonu (BHI) ile dolu test tüplerine aktarın. 37 °C’de aerobik koşullarda 18 saat büyüyün. 5 dk. 1….

Representative Results

24 saat ve 48 saat sonra, sağlam çapraz krallık biyofilmler kuyu plakaları geliştirdi. C. albicans ipliksi büyüme değişen derecelerde gösterdi ve S. mutans yüksekliği 35 μm kadar yoğun kümeler oluşturdu. Mantar hyphae etrafında gruplanmış Tek hücre ve S. mutan zincirleri ve büyük hücreler arası boşluklar hacimli bir matrisin varlığını göstermiştir(Şekil S1). Oranmetrik boyanın kalibrasyonu asimetrik sigmoidal eğri<su…

Discussion

C. albicans ve Streptococcus spp içeren çapraz krallık biyofilmlerin ekimi için farklı protokoller. daha önce9,22,23,24,25açıklanmıştır . Ancak, mevcut kurulum basit büyüme koşulları, düzenli çalışma günleri ile uyumlu bir zaman çizelgesi, dengeli bir tür bileşimi ve hacimli biyofilm matris gelişimi üzerinde …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Anette Aakjær Thomsen ve Javier E. Garcia mükemmel teknik destek için kabul edilmektedir. Yazarlar görüntü analizi üzerinde verimli tartışmalar için Rubens Spin-Neto teşekkür ederiz.

Materials

Blood agar plates Statens Serum Institut 677
Brain heart infusion Oxoid CM1135
Brain heart infusion + 5 % sucrose BDH laboratory supplies 10274
Candida albicans National Collection of Pathogenic Fungi NCPF 3179
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
daime: digital image analysis in microbial ecology Universität Wien N/A Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
Fetal bovine serum Gibco Life technologies 10270
GS-6R refrigerated centrifuge Beckman N/A
ImageJ National Institutes of Health N/A Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java Oracle N/A Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well Black Ibidi 89626
MyCurveFit MyAssays Ltd. N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer Bioworld 700728
PHM210 pH-meter Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective Zeiss N/A NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Sterile physiological saline VWR 6404
Streptococcus mutans Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC VWR N/A
XL Incubator PeCON N/A
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).

Tags

Cross-kingdom BiofilmsStreptococcus MutansCandida AlbicansConfocal MicroscopyPH RatiometryExtracellular MatrixMicrobial MetabolismBiofilm GrowthSalivary SolutionFetal Bovine SerumBrain Heart InfusionSucrose

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Schlafer, S., Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60270, doi:10.3791/60270 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image