Monitoreo del pH extracelular en biopelículas entre reinos mediante microscopía confocal
Summary
El protocolo describe el cultivo de biopelículas entre reinos consistentes en Candida albicans y Streptococcus mutans y presenta un método basado en microscopía confocal para el monitoreo del pH extracelular dentro de estas biopelículas.
Abstract
Las biopelículas entre reinos que consisten en células fúngicas y bacterianas están involucradas en una variedad de enfermedades bucales, como infecciones endodónticas, periodontitis, infecciones mucosas y, sobre todo, caries en la primera infancia. En todas estas condiciones, el pH en la matriz de biopelícula afecta las interacciones microbio-huésped y, por lo tanto, la progresión de la enfermedad. El presente protocolo describe un método basado en microscopía confocal para monitorear la dinámica de pH dentro de biopelículas entre reinos que comprenden Candida albicans y Streptococcus mutans. El espectro de doble emisión dependiente del pH y las propiedades de tinción de la sonda ratiométrica C-SNIF-4 se explotan para determinar las caídas de pH en áreas extracelulares de las biopelículas. El uso de la ratiometría de pH con la sonda requiere una elección meticulosa de parámetros de imagen, una calibración exhaustiva del tinte y un procesamiento posterior cuidadoso y basado en umbrales de los datos de la imagen. Cuando se utiliza correctamente, la técnica permite la evaluación rápida del pH extracelular en diferentes áreas de una biopelícula y, por lo tanto, el seguimiento de los gradientes de pH horizontales y verticales a lo largo del tiempo. Mientras que el uso de microscopía confocal limita el perfilado Z a biopelículas delgadas de 75 m o menos, el uso de ratiometría de pH es ideal para el estudio no invasivo de un factor de virulencia importante en biopelículas entre reinos.
Introduction
Las biopelículas entre reinos que comprenden especies fúngicas y bacterianas están involucradas en varias condiciones patológicas en la cavidad oral. Candida spp. se han aislado con frecuencia de infecciones endodónticas1 y de lesiones periodontales2,3. En las infecciones mucosas, se ha demostrado que las especies estreptocócicas del grupo de mitis mejoran la formación de biopelículas fúngicas, la invasión de tejidos y la diseminación tanto en los modelos in vitro como murinos4,5,6,7. Lo más interesante es que el transporte oral de Candida spp. ha demostrado estar asociado con la prevalencia de caries en niñosde 8años. Como se muestra en los modelos de roedores, una relación simbiótica entre Streptococcus mutans y Candidas albicans aumenta la producción de polisacáridos extracelulares y conduce a la formación de biopelículas más gruesas y cariogénicas9,10.
En todas las condiciones antes mencionadas, la caries de la primera infancia en particular, el pH de biopelícula es importante para la progresión de la enfermedad, y el papel eminente de la matriz de biopelículas para el desarrollo de microambientes acidogénicos11 requiere metodologías que permitan estudiar los cambios de pH dentro de las biopelículas entre reinos. Se han desarrollado enfoques simples y precisos basados en microscopía confocal para controlar el pH dentro de las biopelículas bacterianas12 y13 fúngicas. Con el tinte ratiométrico C-SNARF-4 y el postprocesamiento de imágenes basado en umbrales, el pH extracelular se puede determinar en tiempo real en las tres dimensiones de un biofilm14. En comparación con otras técnicas publicadas para el monitoreo de pH basado en microscopía en biopelículas, la ratiometría de pH con C-SNARF-4 es simple y barata, ya que no requiere la síntesis de partículas o compuestos que incluyan un tinte de referencia15 o el uso de la excitación de dos fotones16. El uso de un solo tinte evita problemas con la compartimentación de la sonda, el sangrado fluorescente y el blanqueo selectivo16,17,18, al tiempo que permite una diferenciación fiable entre el pH intra y extracelular. Finalmente, la incubación con el tinte se realiza después del crecimiento del biofilm, lo que permite estudiar tanto biopelículas cultivadas en laboratorio como in situ.
El objetivo del presente trabajo es ampliar el uso de la ratiometría de pH y proporcionar un método para estudiar los cambios de pH en las biopelículas entre reinos. Como prueba de concepto, el método se utiliza para monitorear el pH en biopelículas de dos especies compuestas por S. mutans y C. albicans expuestos a la glucosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferentes protocolos para el cultivo de biopelículas entre reinos con C. albicans y Streptococcus spp. han sido descritos previamente9,22,23,24,25. Sin embargo, la configuración actual se centra en condiciones de crecimiento simples, un cronograma compatible con días laborables regulares, una composición equilibrada de especies …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anette Aakjor Thomsen y Javier E. García son reconocidos por su excelente soporte técnico. Los autores agradecen a Rubens Spin-Neto sus fructíferas discusiones sobre el análisis de imágenes.
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
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