Monitoramento de pH extracelular em biofilmes transversais usando microscopia confocal
Summary
O protocolo descreve o cultivo de biofilmes transversais compostos por candida albicans e streptococcus mutans e apresenta um método confocal baseado em microscopia para o monitoramento de pH extracelular dentro desses biofilmes.
Abstract
Biofilmes transversais que consistem em células fúngicas e bacterianas estão envolvidos em uma variedade de doenças bucais, como infecções endodônticas, periodontite, infecções mucosas e, mais notavelmente, cárinos da primeira infância. Em todas essas condições, o pH na matriz biofilme impacta as interações microbe-hospedeiros e, portanto, a progressão da doença. O protocolo atual descreve um método confocal baseado em microscopia para monitorar a dinâmica do PH dentro de biofilmes entre reinos compostos por candida albicans e streptococcus mutans. O espectro de emissão dupla dependente de pH e as propriedades de coloração da sonda ratiométrica C-SNARF-4 são explorados para determinar quedas no pH em áreas extracelulares dos biofilmes. O uso de ratiometria pH com a sonda requer uma escolha meticulosa de parâmetros de imagem, uma calibração completa do tintura e pós-processamento cuidadoso e baseado em limiar dos dados de imagem. Quando utilizada corretamente, a técnica permite a rápida avaliação do pH extracelular em diferentes áreas de um biofilme e, portanto, o monitoramento de gradientes pH horizontais e verticais ao longo do tempo. Embora o uso de microscopia confocal limite o perfil z a biofilmes finos de 75 μm ou menos, o uso de ratiometria pH é idealmente adequado para o estudo não invasivo de um importante fator de virulência em biofilmes entre reinos.
Introduction
Biofilmes entre reinos compostos por espécies fúngicas e bacterianas estão envolvidos em várias condições patológicas na cavidade oral. Candida spp. tem sido frequentemente isolada de infecções endodônticas1 e de lesões periodontais2,3. Em infecções mucosas, espécies estreptocócicas do grupo de áciculos têm sido mostradas para melhorar a formação fungal de biofilme, invasão de tecidos e disseminação nos modelos in vitro e murina4,5,6,7. Mais interessante, o transporte oral de Candida spp. tem sido comprovado estar associado à prevalência de cáios em crianças8. Como mostrado nos modelos de roedores, uma relação simbiótica entre mutanos streptococcus e candidas albicans aumenta a produção de polissacarídeos extracelulares e leva à formação de biofilmes mais grossos e cariogênicos9,10.
Em todas as condições acima mencionadas, as cárinas da primeira infância, em particular, o pH biofilme é importante para a progressão da doença, e o papel eminente da matriz biocinematográfica para o desenvolvimento de microambientes acidogênicos11 exige metodologias que permitam estudar mudanças de pH dentro de biofilmes transfronteiriços. Abordagens simples e precisas baseadas em microscopia confocal para monitorar pH dentro de biofilmes bacterianos12 e fúngicos13 foram desenvolvidas. Com o dye ratiométrico C-SNARF-4 e o pós-processamento de imagem baseado em limiares, o pH extracelular pode ser determinado em tempo real em todas as três dimensões de um biofilme14. Em comparação com outras técnicas publicadas para monitoramento de pH baseado em microscopia em biofilmes, a ratiometria de pH com C-SNARF-4 é simples e barata, pois não requer a síntese de partículas ou compostos que incluem um tintura de referência15 ou o uso de excitação de dois fótons16. O uso de apenas um corante evita problemas com compartimentação de sondas, sangramento fluorescente e branqueamento seletivo16,17,18, enquanto ainda permite uma diferenciação confiável entre pH intra e extracelular. Finalmente, a incubação com o tintura é realizada após o crescimento do biofilme, que permite estudar tanto laboratório quanto em biofilmes cultivados no situ.
O objetivo do presente trabalho é ampliar o uso da ratiometria de pH e fornecer um método para estudar mudanças de pH em biofilmes inter-reinos. Como prova de conceito, o método é usado para monitorar pH em biofilmes de espécies duplas compostas por s. mutans e c. albicans expostos à glicose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferentes protocolos para o cultivo de biofilmes transcionais envolvendo C. albicans e Streptococcus spp. foram descritos anteriormente9,22,23,24,25. No entanto, a configuração atual se concentra em condições simples de crescimento, um cronograma compatível com dias de trabalho regulares, uma composição de espécies equilibra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anette Aakjær Thomsen e Javier E. Garcia são reconhecidos por excelente suporte técnico. Os autores agradecem a Rubens Spin-Neto por discussões frutíferas sobre análise de imagens.
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
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