共焦点顕微鏡を用いたクロスキングダムバイオフィルムの細胞外pHのモニタリング

真菌種および細菌種の両方を含む界を横断するバイオフィルムは、口腔内のいくつかの病理学的状態に関与している。カンディダ属は、頻繁に歯内感染症¹および歯周病変^2、3から単離されている。粘膜感染症において、ミツチス群由来のレンサ球菌種は、インビトロモデルおよびマウスモデル4、5、6、7の両方で真菌バイオフィルム形成、組織浸潤、および播種を増強することが示されている。最も興味深いことに、カンディダsppの経口運送は、子供⁸における齲虫の蔓延に関連することが証明されている。げっ歯類モデルに示すように、レンサ球菌ミュータンとカンジダスアルビカンスとの共生関係は、細胞外多糖の産生を増加させ、より厚く、より多くの齲蝕性バイオフィルム^9、10の形成をもたらす。

上記のすべての条件において、特に幼児期のうねりは、疾患進行にとってバイオフィルムpHが重要であり、および、酸性マイクロ環境の開発のためのバイオフィルムマトリックスの著しい役割を有し^、11は、クロスキングダムバイオフィルム内のpH変化を研究することを可能にする方法論を求めている。細菌¹²および真菌¹³のバイオフィルムの中のpHを監視するための簡単で正確な共焦点顕微鏡ベースのアプローチが開発されている。レシオメトリック色素C-SNARF-4と閾値ベースの画像後処理により、細胞外pHはバイオフィルム¹⁴の3次元すべてにおいてリアルタイムに決定することができる。バイオフィルムにおける顕微鏡ベースのpHモニタリングに関する他の公開技術と比較して、C-SNARF-4によるpHレシオメトリーは、参照色素¹⁵を含む粒子または化合物の合成または2光子励起¹⁶の使用を必要としないため、簡便かつ安価である。1つの染料を使用するだけで、プローブ区画化、蛍光ブリードスルー、選択的漂白^16、17、18の問題を防ぎ、細胞内pHと細胞外pHの間で信頼性の高い差別化を可能にします。最後に、色素を用いたインキュベーションは、バイオフィルムの成長後に行われ、実験室とその場で成長したバイオフィルムの両方を研究することができます。

本研究の目的は、pHレシオメトリーの使用を拡張し、界を越えたバイオフィルムのpH変化を研究する方法を提供することである。概念実証として、この方法は、グルコースにさらされたS.ミュータンとC.アルビカンスからなる二重種バイオフィルムのpHを監視するために使用される。