מעקב אחר תמציות ביומיסקופיה באמצעות מיקרוסקופ Confocal וקדי
Summary
הפרוטוקול מתאר את הטיפוח של ממלכת הבין-מלכות המורכבת מקנדידה מיקרובינים ו סטרפטוקוקוס ומציג שיטה מבוססת-מיקרוסקופ מבוסס על הניטור של pH מואנים בתוך הביואמים האלה.
Abstract
בין הממלכה ביואמים המורכבת הן בתאי פטרייתי בקטריאלי מעורבים במגוון של מחלות הפה, כגון זיהומים אנדודונטיים, חניכיים, זיהומים רירית, בעיקר, עששת הילדות המוקדמת. בכל התנאים הללו, ה-pH במטריקס משפיע על אינטראקציות מארחות בחיידק ולכן התקדמות המחלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מבוססת על מיקרוסקופיה לניטור הדינמיקה של ה-pH בתוך ביויואמים של הממלכה הכוללת את הקנדידה ו סטרפטוקוקוס. הספקטרום של פליטת הפליטה הכפולה והתכונות המכתימה של בדיקת הטימטרי C-נהם-4 מנוצלים כדי לקבוע טיפות ב-pH באזורים של מסחטות של הביואמים. השימוש ב-pH טימטריה עם הגשוש דורש בחירה מדוקדקת של פרמטרי דימות, כיול יסודי של הצבע, וזהיר, מבוסס הסף על עיבוד הנתונים של התמונה. כאשר נעשה שימוש נכון, הטכניקה מאפשרת הערכה מהירה של pH החילוץ באזורים שונים של ביוilm, ובכך את הניטור של שני מעברי pH אופקי ואנכי לאורך זמן. בעוד שהשימוש במיקרוסקופיה מגבילה את ה-Z-פרופיל ל ביויואמים דקים של 75 יקרומטר או פחות, השימוש ב-pH מטימטריה מתאים באופן אידיאלי למחקר לא פולשני של גורם התקפה אלימה חשובה בתוך ביוילאמים חוצי הממלכה.
Introduction
ביומדי הממלכה, המורכב הן ממינים פטרייתיים וחיידקיים, מעורבים במצבים פתולוגיים בחלל הפה. קנדידה spp לעתים קרובות מבודדים זיהומים אנדודונטיים1 ומפני נגעים חניכיים2,3. בזיהומים רירית, מינים streptococcal מהקבוצה mitis הוכחו לשפר את היווצרות ביופלורין, הפלישה רקמות, והפצת הן בתוך מודלים מחוץ לארץ מורנין4,5,6,7. מעניין ביותר, מנשא אוראלי של קנדידה spp הוכח להיות משויך לשכיחות של עששת אצל ילדים8. כפי שמוצג במודלים של מכרסמים, קשר סימביוטי בין מוגני סטרפטוקוקוס ו קנביאנים אלביקנס מגביר את הייצור של פוליסכפידים של מסחטות ומוביל להיווצרות של ביואמים עבים יותר ויותר9,10.
בכל התנאים שהוזכרו לעיל, העששת המוקדמת בפרט, ה-pH של הביוilm הוא בעל חשיבות להתקדמות המחלה, והתפקיד הנודע של מטריצת הביוilm לפיתוח מיקרויוגניים11 שיחות למתודולוגיות המאפשרות לימוד שינויי pH בתוך ביואמים של הממלכה הצולבת. מיקרוסקופיה פשוטה ומדויקת גישות מבוססות לנטר pH בתוך חיידקי12 ו פטרייתי13 ביואילאמים פותחו. עם לצבוע את הצבע C-נהם-4 ואת הסף מבוסס התמונה לאחר העיבוד, ה-pH החילוץ יכול להיקבע בזמן אמת בכל שלושת הממדים של ביוilm14. לעומת טכניקות אחרות שפורסמו בניטור pH-מבוססי מיקרוסקופ ב-ביואמים, pH מטימטריה עם C-סנף-4 הוא פשוט וזול, כי זה לא דורש סינתזה של חלקיקים או תרכובות הכוללות צבע התייחסות15 או שימוש בשני הפוטון עירור16. השימוש בצבע אחד בלבד מונע בעיות עם מידור בדיקה, פלורסנט בכיוון, ו הלבנה סלקטיבית16,17,18 תוך שהוא עדיין מאפשר בידול אמין בין הפנים והחילוץ pH. בסופו של דבר, הדגירה עם הצבע מבוצעת לאחר הצמיחה של ביוilm, אשר מאפשר ללמוד הן מעבדה והן בתוך מקומיים מגודלים ביואמים.
מטרת העבודה הנוכחית היא להאריך את השימוש ב-pH מטימטריה ולספק שיטה ללימוד שינויי חומציות בביואמים מהממלכה. כהוכחה למושג, השיטה משמשת לניטור pH ב-ביואמים של מינים כפולים, המורכב מ -S. מיונים ו-C. אלביקנס חשופים גלוקוז.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקולים שונים לטיפוח של הממלכה הצולבת ביוגיאמים הקשורים C. אלביקנס ו סטרפטוקוקוס spp. תוארו בעבר9,22,23,24,25. עם זאת, הכיוונון הנוכחי מתמקד בתנאי גדילה פשוטים, לוח זמנים התואם לימי עבודה ר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
והוא מודה בתמיכה טכנית מעולה. המחברים מודים לרובנס-נטו לדיונים פוריים על ניתוח תמונות.
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
- Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).
