Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms met behulp van ConfocalMicroscopie
Summary
Het protocol beschrijft de teelt van cross-kingdom biofilms bestaande uit Candida albicans en Streptococcus mutans en presenteert een confocale microscopie-gebaseerde methode voor het monitoren van extracellulaire pH in deze biofilms.
Abstract
Langlaufbiofilms bestaande uit zowel schimmel- als bacteriële cellen zijn betrokken bij een verscheidenheid aan orale ziekten, zoals endodontische infecties, parodontitis, mucosale infecties en, met name, vroege kindercariës. In al deze omstandigheden beïnvloedt de pH in de biofilmmatrix microbe-host interacties en dus de progressie van de ziekte. Het huidige protocol beschrijft een confocale microscopiegebaseerde methode om de pH-dynamiek te monitoren in cross-kingdom biofilms bestaande uit Candida albicans en Streptococcus mutanen. Het pH-afhankelijke dual-emissiespectrum en de kleureigenschappen van de ratiometrische sonde C-SNARF-4 worden benut om druppels pH te bepalen in extracellulaire gebieden van de biofilms. Het gebruik van pH-ratiometrie met de sonde vereist een zorgvuldige keuze van imaging parameters, een grondige kalibratie van de kleurstof, en zorgvuldige, drempel-gebaseerde nabewerking van de beeldgegevens. Bij correct gebruik maakt de techniek een snelle beoordeling van extracellulaire pH mogelijk in verschillende gebieden van een biofilm en dus de monitoring van zowel horizontale als verticale pH-gradiënten in de tijd. Hoewel het gebruik van confocale microscopie Z-profilering beperkt tot dunne biofilms van 75 μm of minder, is het gebruik van pH-ratiometrie bij uitstek geschikt voor de niet-invasieve studie van een belangrijke virulentiefactor in cross-kingdom biofilms.
Introduction
Langlaufbiofilms bestaande uit zowel schimmel- als bacteriële soorten zijn betrokken bij verschillende pathologische aandoeningen in de mondholte. Candida spp. zijn vaak geïsoleerd van endodontische infecties1 en van parodontale laesies2,3. Bij slijmvliesinfecties is aangetoond dat streptokokkensoorten uit de mitisgroep de vorming van schimmels biofilm, weefselinvasie en verspreiding in zowel in vitro als murinemodellen4,5,6,7verbeteren. Het meest interessant, mondelinge vervoer van Candida spp. is bewezen te worden geassocieerd met de prevalentie van cariës bij kinderen8. Zoals blijkt uit knaagdiermodellen, verhoogt een symbiotische relatie tussen Streptococcus mutans en Candidas albicans de productie van extracellulaire polysachariden en leidt tot de vorming van dikkere en meer cariogene biofilms9,10.
In alle bovengenoemde omstandigheden, met name voor jonge kinderen, is de pH van de biofilm van belang voor de progressie van de ziekte, en de eminente rol van de biofilmmatrix voor de ontwikkeling van acidogene microomgevingen11 vraagt om methodologieën die het bestuderen van pH-veranderingen in cross-kingdom biofilms mogelijk maken. Eenvoudige en nauwkeurige confocale microscopiegebaseerde benaderingen om pH in bacteriële12 en schimmel13 biofilms te monitoren zijn ontwikkeld. Met de ratiometrische kleurstof C-SNARF-4 en op drempels gebaseerde beeldnabewerking kan extracellulaire pH in real-time worden bepaald in alle drie de dimensies van een biofilm14. In vergelijking met andere gepubliceerde technieken voor op microscopie gebaseerde pH-monitoring in biofilms is pH-ratiometrie met C-SNARF-4 eenvoudig en goedkoop, omdat het niet de synthese vereist van deeltjes of verbindingen die een referentiekleurstof15 of het gebruik van tweefotonexcitatie16bevatten . Het gebruik van slechts een kleurstof voorkomt problemen met sonde compartimentering, fluorescerende bleed-through, en selectief bleken16,17,18 terwijl nog steeds rekening houdend met een betrouwbare differentiatie tussen intra- en extracellulaire pH. Ten slotte wordt incubatie met de kleurstof uitgevoerd na de groei van de biofilm, waardoor zowel laboratorium als in situ-gekweekte biofilms kunnen worden bestudeerd.
Het doel van het huidige werk is om het gebruik van pH-ratiometrie uit te breiden en een methode te bieden om pH-veranderingen in cross-kingdom biofilms te bestuderen. Als proof of concept wordt de methode gebruikt om pH te monitoren in biofilms van twee soorten bestaande uit S. mutanen en C. albicans die aan glucose zijn blootgesteld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende protocollen voor de teelt van langlauffolies waarbij C. albicans en Streptococcus spp betrokken zijngeweest . De huidige opstelling richt zich echter op eenvoudige groeiomstandigheden, een tijdschema dat compatibel is met reguliere werkdagen, een evenwichtige soortensamenstelling en de ontwikkeling van een volumineuze b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anette Aakjær Thomsen en Javier E. Garcia worden erkend voor uitstekende technische ondersteuning. De auteurs bedanken Rubens Spin-Neto voor vruchtbare discussies over beeldanalyse.
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
- Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).
