Roman Biyotinilasyon Enzimlerinin Seçimi için Bakteriyel Peptit Gösterimi
Summary
Burada e. coli biotin-protein ligase BirA’nın belirli bir hedef peptidbiyominiyapan yeni varyantları için seçme yöntemi salıyoruz. Protokol, hedef peptidin bakteriyel olarak görüntülenmesi için bir plazmid yapımını, BirA kütüphanesinin neslinin, BirA varyantlarının seçilmesi ve karakterizasyonunun yapılmasını açıklar.
Abstract
Biotin, proteinlerin izolasyonu ve tespiti için güçlü bir etiket sağlayan, çeviri sonrası çekici bir modifikasyondur. E. coli biotin-protein ligaz BirA tarafından enzimatik biyotinylasyon son derece spesifik tir ve hedef proteinlerin yerli ortamında biyotinylasyon sağlar; ancak, BirA aracılı biyotinylation mevcut kullanımı hedef protein sentetik bir kabul veya peptid (AP) varlığını gerektirir. Bu nedenle, uygulama AP içerecek şekilde tasarlanmış proteinler ile sınırlıdır. Bu protokolün amacı, peptidbiyoni yapan BirA varyantları için seçilen değiştirilmemiş bir hedef proteinden elde edilen bir peptitin bakteriyel ekranını kullanmaktır. Sistem bakteriyel yüzeyde peptit ekran için bir iskele ile birlikte BirA varyantları co-ifade sağlayan tek bir plazmid dayanmaktadır. Protokol, hedef peptidin ekran iskelesine dahil edilmesi, BirA kütüphanesinin oluşturulması, aktif BirA varyantlarının seçilmesi ve izole Edilmiş BirA varyantlarının ilk karakterizasyonu için ayrıntılı bir prosedürü açıklar. Bu yöntem, biyotin-protein ligaseslerinin daha da karmaşık çözeltilerde yerli proteini biyotinyle ile yönlendirilen evrimi için kullanılabilecek yeni BirA varyantlarının izolasyonu için son derece etkili bir seçim sistemi sağlar.
Introduction
Bir proteinin biyotinylation onun yakınlık izolasyon ve algılama için güçlü bir etiket oluşturur. Enzimatik protein biyotinylasyonu, biyotin-protein ligasesleri ile katalize edilen çok spesifik bir post-translational modifikasyondur. E. coli biotin-protein ligaz BirA son derece spesifik ve kovalent biyotinylates belirli lizin artıkları sadece sınırlı sayıda doğal olarak oluşan proteinler1. BirA katalize biyotinylasyon avantajları şu anda küçük bir sentetik 15-amino-asit biyotin kabul peptid (AP) ile hedef protein eritilmesi ile harnessedolan etkili biyotinylated 2 ve son derece spesifik ve sağlar bir a3,4,5ile birlikte ekspresyonu veya ilavesi ile in vitro biyotinylasyon verimli. In vivo ve in vitro BirA katalize biotin-protein ligasyonu cazip bir etiketleme stratejisi olmasına rağmen, uygulama AP-erimiş proteinler içeren örnekler ile sınırlıdır. Bu yöntemin amacı, yerli modifiye edilmemiş proteinleri seçici olarak biyotinylate ve böylece enzimatik biyotinylation stratejisinin kullanılabildiği uygulamaların sayısını artıran yeni biyotin-protein ligazlarının geliştirilmesidir.
Protein fonksiyonu gen mutasyonunun yinelemeli turları ile evrilebilir, gen varyantlarının istenilen fonksiyonla seçilmesi ve amplifikasyonu. Güçlü ve verimli bir seçim stratejisi yönlendirilmiş evrim için çok önemlidir ve biotin-protein ligaz aktivitesi biotin ve streptavidin ve homologlar arasındaki güçlü bağlanma nedeniyle kolayca seçilir6. Faj görüntüleme teknolojileri biyotinylated peptidler görüntülemek fajların seçimi için izin7,8. İzole fajların amplifikasyonu bakteriyel konak enfeksiyonu gerektirdiğinden, ancak streptavidin ile faj seçimi, biotinin streptavidin için yüksek afinite bağlama non-denaturing altında hemen hemen geri dönüşümsüz olduğu bir darboğaz oluşturur Koşul -ları. Biyotinylated fajlar geri dönüşümlü bağlanmasını sağlamak için, düşük afinite ile monomerik avidinler mütevazı ~ 10 kat zenginleştirme7sonuçlandı kullanılmıştır. Yakın zamanda yakınlık matrise olan elüsasyon ihtiyacını ortadan kaldıran ve önceki BirA seçim sistemlerinden bir darboğaz çıkaran yeni BirA varyantlarının izolasyonu için bakteriyel bir görüntüleme yöntemi geliştirdik9. Gerçekten de, bizim bakteriyel ekran sistemi tek bir seçim adım9aktif klonların bir >1.000.000 kat zenginleştirme sağlar , böylece roman BirA varyantları yönlendirilen evrim için etkili bir seçim sistemi sağlayan.
Bakteriyel titreşme sistemimiz, C-terminal 6xHis etiketine sahip BirA ve hedef peptidin yüzeyde görüntülenmesini sağlayan bir iskele proteini olmak üzere iki bileşenden oluşur. Biz iskelet proteini kullanılan dairesel permuted dış membran protein X (eCPX) peptidlerin etkili ekran hem De görülebilir beri- ve C-termini10,11. Hedef peptid dizisinin eCPX’in C-terminusuna füzyonu aktif BirA varyantlarını ifade eden bakterilerin biyotinylasyonunu sağlar. Bakteriler biyotinylated peptid şimdi yüzeyde görüntüler gibi etkili streptavidin seçimi için izin(Şekil 1a).
Bu yöntemin amacı, yerli proteinlerde bulunan peptit dizilerini biyotinylates BirA yeni varyantları için seçmektir. Sistem plazmid pBAD-BirA-eCPX-AP mevcut genler tarafından kodlanır, bir arabinose-indüklemez organizatörü BirA kontrol içeren (araBAD), ve bir T7 organizatörü eCPX kontrol9 (Şekil 1b). Bu protokol, hedef proteinden elde edilen bir peptitin eCPX’in C-terminaline dahil edilmesi, 2) hata yatkın PCR ile BirA mutasyonel kütüphanesinin oluşturulması, 3) streptavidin bağlayıcı bakterilerin seçilmesi için ayrıntılı prosedürü açıklar. manyetik aktive hücre tasnifikasyonu (MACS), 4) bakteri zenginleştirme nicelik, ve 5) izole klonların ilk karakterizasyonu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm seçim yöntemlerine gelince, yıkama adımlarının sıkılığı son derece önemlidir. Bakterilerin seçilen klonların amplifikasyonönce boncuklardan eluted gerek olmadığından, biotin ve streptavidin arasındaki yüksek yakınlık bağlayıcı yerine daha düşük afinite avidinler kullanarak kullanılabilir, daha önce faj görüntüleme sistemi ile yapılan, için BirA varyantları seçimi7,8. Bu, nadir klonların seçilmesini ve biyotinylated olma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar uzman teknisyen yardım için Mohamed Abdullahi Ahmed teşekkür ederim. Bu çalışma Lundbeck Vakfı, Novo Nordisk Vakfı, Danimarka Böbrek Derneği, Aase og Ejnar Danielsen Vakfı, A.P. Møller Tıp Biliminin İlerlemesi Vakfı ve Knud ve Edith Eriksen’in bağışları ile desteklendi. Anıt Vakfı.
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme’s Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
