Pantalla de péptido sinábicos para la selección de nuevas enzimas biotinylantantes

La biotinylación de una proteína crea una etiqueta poderosa para su aislamiento y detección de afinidad. La biotinylación de proteínas enzimáticas es una modificación post-traduccional altamente específica catalizada por ligasas de biotina y proteína. La E. coli biotin-protein ligase BirA es extremadamente específica y covalentemente biotinyla sólo un número restringido de proteínas de origen natural en residuos específicos de lisina¹. Las ventajas de la biotinilación catalizada por BirA se aprovechan actualmente fusionando la proteína diana con un pequeño péptido sintético de 15 aminoácidos que acepta la biotina (AP) que se biotintiza eficazmente² y permite el altamente específico y biotinylación eficiente in vivo e in vitro por coexpresión o adición de BirA^3,4,5. Aunque la ligadura biotina-proteína catalizada in vivo e in vitro de BirA es una estrategia de etiquetado atractiva, su aplicación se limita a muestras que contienen proteínas fusionadas con AP. El propósito de este método es el desarrollo de nuevos mutantes de ligasas biotina-proteína que biotinylan selectivamente proteínas nativas no modificadas y, de este modo, ampliar el número de aplicaciones en las que se puede utilizar la estrategia de biotintinación enzimática.

La función proteica se puede evolucionar a través de rondas iterativas de la mutación genética, selección y amplificación de variantes genéticas con la función deseada. Una estrategia de selección fuerte y eficiente es crucial para la evolución dirigida y la actividad de la ligasa de proteína sin biotina se selecciona fácilmente debido a la fuerte unión entre la biotina y la estreptavidina y sus homólogos^6. Las tecnologías de visualización de Phage permiten la selección de fagos que muestran péptidos biotinilados^7,8. Dado que la amplificación de fagos aislados requiere la infección de un huésped bacteriano, sin embargo, la selección del fago con estreptavidina crea un cuello de botella en el que la unión de alta afinidad de biotina a la estreptavidina es prácticamente irreversible bajo la no desnaturalización Condiciones. Para garantizar la unión reversible de fagos biotinilados, se utilizaron ávidinas monoméricas con menor afinidad que dieron lugar a un modesto enriquecimiento de¹⁰veces 7 . Recientemente hemos desarrollado un método de visualización bacteriana para el aislamiento de nuevas variantes BirA que elimina la necesidad de la elución de la matriz de afinidad y por lo que elimina un cuello de botella de los sistemas de selección BirA anteriores⁹. De hecho, nuestro sistema de visualización bacteriana permite un enriquecimiento de 1.000.000 de clones activos en un solo paso de selección^9,proporcionando así un sistema de selección eficaz para la evolución dirigida de las nuevas variantes BirA.

Nuestro sistema de visualización bacteriana consta de dos componentes, BirA con una etiqueta C-terminal 6xHis y una proteína de andamio que permite la visualización superficial de un péptido objetivo. Utilizamos la proteína andamio mejorada circularmente permutada proteína de membrana externa X (eCPX) ya que la visualización efectiva de péptidos se puede observar tanto en el N- y C-termini^10,11. La fusión de la secuencia de péptidos diana con el Término C de eCPX asegura la biotinilación de bacterias que expresan variantes activas de BirA. Las bacterias permiten la selección efectiva de la estreptavidina, ya que el péptido biotintilado ahora se muestra en la superficie(Figura 1a).

El propósito de este método es seleccionar para nuevas variantes de BirA que biotinylates secuencias de péptidos presentes en proteínas nativas. El sistema está codificado por genes presentes en el plásmido pBAD-BirA-eCPX-AP, que contiene un promotor inducible de arabinosa que controla BirA (araBAD), y un promotor T7 que controla eCPX⁹ (Figura 1b). El presente protocolo describe el procedimiento detallado para 1) la incorporación de un péptido derivado de una proteína diana en el terminal C de eCPX, 2) la creación de una biblioteca mutacional de BirA mediante PCR propensa a errores, 3) selección de bacterias de unión a la estreptavidina por clasificación celular activada magnéticamente (MACS), 4) cuantificación del enriquecimiento de bacterias y 5) caracterización inicial de clones aislados.