Здесь мы представляем метод, чтобы выбрать для новых вариантов E. coli биотин-протеин лигаза BirA, что биотинилаты конкретной цели пептид. Протокол описывает конструкцию плазмида для бактериального отображения целевого пептида, генерацию библиотеки BirA, выбор и характеристику вариантов BirA.
Биотин является привлекательной посттрансляционной модификацией белков, которая обеспечивает мощный тег для изоляции и обнаружения белка. Энзиматическая биоинжиниляция e. coli биотина-белка ligase BirA является весьма специфической и позволяет биотинилацию целевых белков в их родной среде; однако, текущее использование BirA опосредоченной биотиниляции требует присутствия синтетического пептида приемного (AP) в целевом белке. Таким образом, его применение ограничивается белками, которые были разработаны, чтобы содержать AP. Цель настоящего протокола заключается в использовании бактериального отображения пептида, полученного из неизмененного белка-мишени, для выбора вариантов BirA, которые биотинилатируют пептид. Система основана на одной плазмиде, которая позволяет совместно выражать варианты BirA вместе с эшафотом для пептидного дисплея на бактериальной поверхности. Протокол описывает детальную процедуру включения целевого пептида в эшафот дисплея, создание библиотеки BirA, выбор активных вариантов BirA и первоначальную характеристику изолированных вариантов BirA. Метод обеспечивает высокоэффективную систему отбора для изоляции новых вариантов BirA, которые могут быть использованы для дальнейшей направленной эволюции биотин-белковых лигазов, которые биотинилат родной белок в сложных растворах.
Биотинилация белка создает мощный тег для его изоляции сродства и обнаружения. Биотинилация ферментативного белка является весьма специфической посттрансляционной модификацией, катализированной биотин-белковыми лигазами. E. coli биотин-протеина лигаза BirA является чрезвычайно специфическим и ковалентно биотинилатов только ограниченное количество естественных белков на конкретных остатков лизина1. Преимущества катализированной биотиниляции BirA в настоящее время используются путем сплавления целевого белка с небольшим синтетическим 15-аминокислотным биотином пептида (AP), который эффективно биоинтиниляции2 и позволяет высокоспецифические и эффективное in vivo и in vitro биотинилация путем совместного выражения или добавления BirA3,4,5. Хотя in vivo и in vitro BirA катализируют сяврин-белковую перевязку является привлекательной стратегией маркировки, ее применение ограничено образцами, содержащими слитые AP белки. Целью этого метода является разработка новых мутантов биотин-белковых лигазов, которые избирательно биотинилат местные неизмененные белки и, тем самым, расширяют количество применений, в которых может быть использована ферментативная стратегия биоинжиниляции.
Белковая функция может развиваться с помощью итеративных раундов генной мутации, выделения и усиления вариантов генов с желаемой функцией. Сильная и эффективная стратегия отбора имеет решающее значение для направленной эволюции и биотин-протеиновой лигазной активности легко подобрана из-за сильной связывания между биотином и стрептавидином и его омологами6. Технологии фаги позволяют подбирать фаги, которые отображают биотинилатные пептиды7,8. Поскольку усиление изолированных фагов требует заражения бактериального хозяина, однако, выбор фага стрептавидинсоздает узкое место в том, что высокородность связывания биотина стрептавидин практически необратимым под не-денатурация Условия. Для обеспечения обратимого связывания биотининатированных фагов использовались мономерные алдины с более низким сродством, что привело к скромному обогащениюв10 раз. Недавно мы разработали метод бактериального дисплея для изоляции новых вариантов BirA, который устраняет необходимость в elution из матрицы сродства и тем самым удаляет узкое место из предыдущих систем отбора BirA9. В самом деле, наша бактериальная система отображения позволяет для 1000000 раз обогащение активных клонов в одном шаге отбора9, таким образом, обеспечивая эффективную систему отбора для направленной эволюции романа BirA вариантов.
Наша бактериальная система отображения состоит из двух компонентов, BirA с C-терминал 6xHis тег и эшафот белка, что позволяет для поверхности отображения целевого пептида. Мы использовали эшафот белка расширения круговой пермутированный наружной мембраны белка X (eCPX), так как эффективное отображение пептидов можно наблюдать как на N- и C-терминини10,11. Слияние целевой пептидной последовательности с C-термином eCPX обеспечивает биотинилацию бактерий, выражающих активные варианты BirA. Бактерии позволяют для эффективного выбора стрептавидина, как биотинилаповый пептид теперь отображается на поверхности(Рисунок 1a).
Цель юаней – отобрать для новых вариантов BirA, которые биотинилатируют пептидные последовательности, присутствующие в местных белках. Система кодируется генами, присутствующими на плазмидном pBAD-BirA-eCPX-AP, который содержит арабинос-индуцированный промоутер, контролирующий BirA (araBAD), и промоутер T7, контролирующий eCPX9 (Рисунок 1b). Настоящий протокол описывает детальную процедуру для 1) включения пептида, полученного из целевого белка, в C-терминал eCPX, 2) создание мутационной библиотеки BirA по подверженным ошибкам ПЦР, 3) выбор стрептавидиновых бактерий сортировка клеток с магнитным активированным (MACS), 4) количественная оценка обогащения бактерий и 5) первоначальная характеристика изолированных клонов.
Что касается всех методов отбора, строгость стирки шагов имеет первостепенное значение. Так как бактерии не должны быть eluted от бисера до усиления выбранных клонов, высокое сродство связывания между биотином и стрептавидин может быть использован вместо использования нижней сродности ?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Мохамеда Абдуллахи Ахмеда за помощь специалиста-технического специалиста. Эта работа была поддержана грантами Фонда Лундбека, Фонда Ново Нордиска, Датской ассоциации почек, Фонда Аасе ог. Эйнара Даниэлсена, Фонда А.П. Мюллера по развитию медицинской науки, а также Кнуда и Эдит Эриксен Мемориальный фонд.
10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
Tryptone | Millipore | T9410 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |