Summary

Бактериальный пептидный дисплей для выбора новых биотинилатирующих ферментов

Published: October 03, 2019
doi:

Summary

Здесь мы представляем метод, чтобы выбрать для новых вариантов E. coli биотин-протеин лигаза BirA, что биотинилаты конкретной цели пептид. Протокол описывает конструкцию плазмида для бактериального отображения целевого пептида, генерацию библиотеки BirA, выбор и характеристику вариантов BirA.

Abstract

Биотин является привлекательной посттрансляционной модификацией белков, которая обеспечивает мощный тег для изоляции и обнаружения белка. Энзиматическая биоинжиниляция e. coli биотина-белка ligase BirA является весьма специфической и позволяет биотинилацию целевых белков в их родной среде; однако, текущее использование BirA опосредоченной биотиниляции требует присутствия синтетического пептида приемного (AP) в целевом белке. Таким образом, его применение ограничивается белками, которые были разработаны, чтобы содержать AP. Цель настоящего протокола заключается в использовании бактериального отображения пептида, полученного из неизмененного белка-мишени, для выбора вариантов BirA, которые биотинилатируют пептид. Система основана на одной плазмиде, которая позволяет совместно выражать варианты BirA вместе с эшафотом для пептидного дисплея на бактериальной поверхности. Протокол описывает детальную процедуру включения целевого пептида в эшафот дисплея, создание библиотеки BirA, выбор активных вариантов BirA и первоначальную характеристику изолированных вариантов BirA. Метод обеспечивает высокоэффективную систему отбора для изоляции новых вариантов BirA, которые могут быть использованы для дальнейшей направленной эволюции биотин-белковых лигазов, которые биотинилат родной белок в сложных растворах.

Introduction

Биотинилация белка создает мощный тег для его изоляции сродства и обнаружения. Биотинилация ферментативного белка является весьма специфической посттрансляционной модификацией, катализированной биотин-белковыми лигазами. E. coli биотин-протеина лигаза BirA является чрезвычайно специфическим и ковалентно биотинилатов только ограниченное количество естественных белков на конкретных остатков лизина1. Преимущества катализированной биотиниляции BirA в настоящее время используются путем сплавления целевого белка с небольшим синтетическим 15-аминокислотным биотином пептида (AP), который эффективно биоинтиниляции2 и позволяет высокоспецифические и эффективное in vivo и in vitro биотинилация путем совместного выражения или добавления BirA3,4,5. Хотя in vivo и in vitro BirA катализируют сяврин-белковую перевязку является привлекательной стратегией маркировки, ее применение ограничено образцами, содержащими слитые AP белки. Целью этого метода является разработка новых мутантов биотин-белковых лигазов, которые избирательно биотинилат местные неизмененные белки и, тем самым, расширяют количество применений, в которых может быть использована ферментативная стратегия биоинжиниляции.

Белковая функция может развиваться с помощью итеративных раундов генной мутации, выделения и усиления вариантов генов с желаемой функцией. Сильная и эффективная стратегия отбора имеет решающее значение для направленной эволюции и биотин-протеиновой лигазной активности легко подобрана из-за сильной связывания между биотином и стрептавидином и его омологами6. Технологии фаги позволяют подбирать фаги, которые отображают биотинилатные пептиды7,8. Поскольку усиление изолированных фагов требует заражения бактериального хозяина, однако, выбор фага стрептавидинсоздает узкое место в том, что высокородность связывания биотина стрептавидин практически необратимым под не-денатурация Условия. Для обеспечения обратимого связывания биотининатированных фагов использовались мономерные алдины с более низким сродством, что привело к скромному обогащениюв10 раз. Недавно мы разработали метод бактериального дисплея для изоляции новых вариантов BirA, который устраняет необходимость в elution из матрицы сродства и тем самым удаляет узкое место из предыдущих систем отбора BirA9. В самом деле, наша бактериальная система отображения позволяет для 1000000 раз обогащение активных клонов в одном шаге отбора9, таким образом, обеспечивая эффективную систему отбора для направленной эволюции романа BirA вариантов.

Наша бактериальная система отображения состоит из двух компонентов, BirA с C-терминал 6xHis тег и эшафот белка, что позволяет для поверхности отображения целевого пептида. Мы использовали эшафот белка расширения круговой пермутированный наружной мембраны белка X (eCPX), так как эффективное отображение пептидов можно наблюдать как на N- и C-терминини10,11. Слияние целевой пептидной последовательности с C-термином eCPX обеспечивает биотинилацию бактерий, выражающих активные варианты BirA. Бактерии позволяют для эффективного выбора стрептавидина, как биотинилаповый пептид теперь отображается на поверхности(Рисунок 1a).

Цель юаней – отобрать для новых вариантов BirA, которые биотинилатируют пептидные последовательности, присутствующие в местных белках. Система кодируется генами, присутствующими на плазмидном pBAD-BirA-eCPX-AP, который содержит арабинос-индуцированный промоутер, контролирующий BirA (araBAD), и промоутер T7, контролирующий eCPX9 (Рисунок 1b). Настоящий протокол описывает детальную процедуру для 1) включения пептида, полученного из целевого белка, в C-терминал eCPX, 2) создание мутационной библиотеки BirA по подверженным ошибкам ПЦР, 3) выбор стрептавидиновых бактерий сортировка клеток с магнитным активированным (MACS), 4) количественная оценка обогащения бактерий и 5) первоначальная характеристика изолированных клонов.

Protocol

1. Вставка пептидкодирования секвенирования последовательности в pBAD BirA-eCPX-AP ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выбрать для BirA варианты, которые биотинилат родной белка цели, начните с определения 15-аминокислоты пептид последовательности в белках первичной последовательности, к?…

Representative Results

Западный пятно pBAD-BirA-eCPX-AP, выражающие бактерии, производит стрептавидин-реакционную полосу в соответствии с молекулярным весом eCPX(Рисунок 2a). В отличие от BirA-6xHis, биотинилаповые eCPX-AP присутствовал как в неиндуцированных и индуцированных культур (Рису…

Discussion

Что касается всех методов отбора, строгость стирки шагов имеет первостепенное значение. Так как бактерии не должны быть eluted от бисера до усиления выбранных клонов, высокое сродство связывания между биотином и стрептавидин может быть использован вместо использования нижней сродности ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Мохамеда Абдуллахи Ахмеда за помощь специалиста-технического специалиста. Эта работа была поддержана грантами Фонда Лундбека, Фонда Ново Нордиска, Датской ассоциации почек, Фонда Аасе ог. Эйнара Даниэлсена, Фонда А.П. Мюллера по развитию медицинской науки, а также Кнуда и Эдит Эриксен Мемориальный фонд.

Materials

10% precast polyacrylamide gel Bio-Rad 4561033
Ampicilin Sigma-Aldrich A1593
ApE – A plasmid editor v2.0 NA NA downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
Biotin Sigma-Aldrich B4501
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFischer Scientific 14200083
DpnI restriction enzyme New England BioLabs R0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 ThermoFischer Scientific 65001
GenElute Plasmid Miniprep Kit Sigma-Aldrich PLN350
GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit Agilent Technologies 200552
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Immobilon-P PVDF Membrane Millipore IPVH15150
IPTG Sigma-Aldrich I6758
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NEB 5-alpha Competent E. coli New England BioLabs C2987
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFischer Scientific NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) ThermoFischer Scientific NP0009
pBAD-BirA-eCPX-AP Addgene 121907 Used a template and positive control
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) Addgene 121908 negative control
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491 For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
Skim Milk Powder Sigma-Aldrich 70166
Streptavidin-HRP Agilent Technologies P0397
T7 Express lysY/Iq Competent E. coli New England BioLabs C3013
Tryptone Millipore T9410
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Western Lightning Plus-ECL PerkinElmer NEL103001EA
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625

References

  1. Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
  2. Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
  3. de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
  4. Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
  5. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  6. Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
  7. Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme’s Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
  8. Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
  9. Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
  10. Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
  11. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
  12. Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).

Play Video

Cite This Article
Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes. J. Vis. Exp. (152), e60266, doi:10.3791/60266 (2019).

View Video