Exposição bacteriana do peptide para a seleção de enzimas Biotinylating novas

A biotinilação de uma proteína cria uma etiqueta poderosa para seu isolamento e detecção de afinidade. A biotinilação de proteínas enzimáticas é uma modificação pós-translacional altamente específica catalisada por ligases de biotina-proteína. A ligase de proteína de E. coli Bira é extremamente específica e covalentemente biotinylates apenas um número restrito de proteínas que ocorrem naturalmente em resíduos específicos de lisina¹. As vantagens da biotinilação catalisada pelo BirA são atualmente aproveitadas pela fusão da proteína-alvo com um pequeno peptídeo aceitador de biotina de 15 aminoácidos sintéticos (AP) que é efetivamente biotinilado² e permite o altamente específico e biotinilação in vivo e in vitro eficiente por coexpressão ou adição de Bira^3,4,5. Embora a ligadura de biotina-proteína catalisada in vivo e in vitro seja uma estratégia de rotulagem atrativa, sua aplicação é limitada a amostras que contenham proteínas fundidas por AP. O objetivo deste método é o desenvolvimento de novos mutantes de ligases de biotina-proteína que seletivamente biotinylate proteínas nativas não modificadas e, assim, ampliar o número de aplicações em que a estratégia de biotinilação enzimática pode ser usada.

A função protéica pode ser evoluída através de rodadas iterativas da mutação genética, seleção e amplificação de variantes genéticas com a função desejada. Uma estratégia de seleção forte e eficiente é crucial para a evolução dirigida e a atividade da ligase da biotina-proteína é prontamente selecionada devido à forte ligação entre a biotina e a streptavidina e seus homólogos⁶. As tecnologias de display phage permitem a seleção de fagos que exibem peptídeos biotinilados^7,8. Desde que a amplificação de fagos isolados exige a infecção de um anfitrião bacteriano, entretanto, a seleção do fago com estreptavidina cria um gargalo que a ligação da elevado-afinidade da biotina ao estreptavidina é virtualmente irreversível não-desnaturando Condições. Para assegurar a ligação reversível de phages biotinylated, os avidins monoméricas com mais baixa afinidade foram usados que conduziram a um enriquecimento modesto de ~ 10 vezes⁷. Nós desenvolvemos recentemente um método bacteriano da exposição para o isolamento de variantes novas de BirA que elimina a necessidade para a eluição da matriz da afinidade e remove desse modo um gargalo dos sistemas precedentes da seleção de BirA⁹. Na verdade, nosso sistema de exibição bacteriana permite um enriquecimento de > 1, 000, 000 vezes de clones ativos em uma única etapa de seleção⁹, proporcionando assim um sistema de seleção eficaz para a evolução dirigida de novas variantes Bira.

Nosso sistema bacteriano da exposição consiste em dois componentes, BirA com um Tag do C-terminal 6xHis e uma proteína do andaime que permita a exposição de superfície de um peptide do alvo. Utilizou-se a proteína de membrana externa reforçada circularmente permutada de proteínas de andaime X (eCPX), uma vez que a exposição efetiva de peptídeos pode ser observada tanto no N-e C-Termini^10,11. A fusão da sequência peptídica alvo para o C-Terminus de eCPX assegura a biotinilação de bactérias expressando variantes de BirA ativas. As bactérias permitem a seleção efetiva de streptavidina como o peptídeo biotinilado agora é exibido na superfície (Figura 1a).

A finalidade deste método é selecionar para variantes novas de BirA que as seqüências do peptide dos biotinylates atuais em proteínas nativas. O sistema é codificado por genes presentes no plasmídeo pBAD-BirA-eCPX-AP, que contém um promotor de arabinose-inducible controlando BirA (araBAD), e um promotor T7 controlando eCPX⁹ (Figura 1b). O presente protocolo descreve o procedimento detalhado para 1) incorporação de um peptídeo derivado de uma proteína alvo para o C-terminal de eCPX, 2) criação de uma biblioteca mutacional de BirA por PCR propenso a erros, 3) seleção de bactérias ligantes de streptavidina por classificação de células ativadas por magnético (MACS), 4) quantificação do enriquecimento de bactérias e 5) caracterização inicial de clones isolados.