התצוגה פפטיד בקטריאלי לבחירת הרומן הביוטילדירוג אנזימים
Summary
כאן אנו מציגים שיטה לבחור עבור גרסאות הרומן של E. coli biotin-חלבון ליגאז בירה כי הביוטיטים מטרה מסוימת פפטיד. הפרוטוקול מתאר את בניית הפלסמיד לתצוגה החיידקית של פפטיד היעד, הדור של ספריית בירה, בחירה ואפיון של משתני בירה.
Abstract
Biotin הוא שינוי אטרקטיבי לאחר השינוי של חלבונים המספקת תג רב עוצמה עבור בידוד וזיהוי של חלבון. הביונילציה האנזימטית ע י החיידק הביוטין-ליאג-חלבון הוא מאוד ספציפי ומאפשר לביוטילציה של חלבונים מטרה בסביבתם הטבעית; עם זאת, השימוש הנוכחי של ביוקטילציה בירה מצריך נוכחות של פפטיד סינתטי (AP) בחלבון היעד. לכן, היישום שלו מוגבל לחלבונים שעברו הנדסה כדי להכיל את ה-AP. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להשתמש בתצוגה החיידקית של פפטיד שנגזר מחלבון מטרה שאינו שינה לבחור עבור משתני בירה שביוטיטים את הפפטיד. המערכת מבוססת על פלסמיד יחיד המאפשר ביטוי משותף של משתני בירה יחד עם פיגום לתצוגה פפטיד על פני החיידקים. הפרוטוקול מתאר הליך מפורט לשילוב פפטיד היעד לפיגום התצוגה, יצירת ספריית בירה, מבחר משתני בירה פעילים ואפיון ראשוני של משתני בירה מבודדים. השיטה מספקת מערכת בחירה יעילה ביותר לבידוד של משתני בירה חדשניים, שניתן להשתמש בהם להתפתחות מכוונת נוספת של ביוטין-חלבון, אשר בbiotinylate אוחר יותר חלבון מקורי בפתרונות מורכבים.
Introduction
ביוטילציה של חלבון יוצר תגית רבת עוצמה לבידוד ולגילוי האהדה שלו. ביוטילציה חלבון אנזימטית הוא שינוי מיוחד ביותר שלאחר השינוי באמצעות חלבון ביולוגי. ה- E. coli ביוטין-חלבון ליגאז בירה הוא מאוד ספציפי ומאוד biotinylates רק מספר מוגבל של חלבונים המתרחשים באופן טבעי על שאריות ליזין ספציפי1. היתרונות של הביוטילציה של הבירה מכוונים כיום על ידי החדרת חלבון היעד באמצעות ביוטין (AP) קטן מלאכותי של 15-חומצות אמינו ביולוגי-פפטיד, שהוא ביולוגי הביוטיליס2 ומאפשר את הספציפי וה יעיל בvivo ובביוטילציה על ידי ביטוי משותף או תוספת של בירה3,4,5. למרות vivo ו בירה מחוץ למבחנה ביוטין-חלבון לחות היא אסטרטגיה מושכת תיוג, היישום שלה מוגבל דגימות המכילות חלבונים AP-התמזגו. מטרת שיטה זו היא התפתחות של מוטציות חדשות של ביוטין-חלבון ליגסים, כי באופן סלקטיבי ביולוגי מקורי חלבונים שאינם שונו, ובכך להרחיב את מספר היישומים בהם ניתן להשתמש באסטרטגיית הביוטילציה האנזימטית.
פונקציית חלבון ניתן להתפתח באמצעות סיבובים איטרטיביים של מוטציה גן, בחירה, הגברה של משתני גנים עם הפונקציה הרצויה. אסטרטגיה בחירה חזקה ויעילה היא חיונית עבור האבולוציה המנותבת ו ביוטין-חלבון ליגאז הפעילות מסומנת בקלות בשל הכריכה חזקה בין ביוטין ו streptavidin ו הומויומנים שלה6. טכנולוגיית התצוגה phage לאפשר את הבחירה של phage המציגות פפטידים biotinylated7,8. מאז הגברה של phages מבודדים דורש זיהום של מארח בקטריאלי, עם זאת, בחירת phages עם streptavidin יוצר צוואר בקבוק כי איגוד האהדה הגבוהה של ביוטין לstreptavidin הוא כמעט בלתי הפיך תחת לא מודצות תנאים. כדי להבטיח את הכריכה ההפיכה של phages ביולוגית, השתמשו במונמאריק אבידינס עם זיקהנמוכה יותר,שהביאה לעשרה בעלי קיפול צנוע של 10%. פיתחנו לאחרונה שיטת תצוגה בקטריאלי לבידוד של משתני בירה החדשניים המבטלת את הצורך להתחמק ממטריצת הזיקה ובכך מסירה צוואר בקבוק ממערכות הבחירה הקודמות9. אכן, מערכת התצוגה החיידקית שלנו מאפשרת ל> 1, 000, 000-קיפול של שיבוטים פעילים בשלב בחירה יחיד9, ובכך לספק מערכת בחירה יעילה עבור האבולוציה מכוונת של משתני בירה הרומן.
מערכת התצוגה החיידקית שלנו מורכבת משני מרכיבים, בירה עם תג C-טרמינל 6xHis וחלבון הגרדום המאפשר להציג את המשטח של פפטיד מטרה. השתמשנו בחלבון הפיגום מעגלי משופרת מעגליות חלבון ממברנה החיצוני X (eCPX) מאז התצוגה האפקטיבית של פפטידים ניתן לצפות הן N-ו-C-termini10,11. המיזוג של רצף פפטיד היעד ל C-הטרמינוס של eCPX מבטיח ביוקטילציה של חיידקים המבטאים משתני בירה פעילים. החיידק מאפשר בחירה streptavidin אפקטיבית כמו פפטיד ביולוגי מוצג כעת על פני השטח (איור 1א).
מטרת שיטה זו היא לבחור לגרסאות החדשניים של בירה כי רצפי פפטיד biotinylates קיימים בחלבונים יליד. המערכת מוצפנת על ידי הגנים הנמצאים על pBAD-בירה-eCPX-AP, אשר מכיל את השליטה arabinose-inducible יזם שליטה בירה (araBAD), ומקדם T7 השליטה eCPX9 (איור 1b). הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההליך המפורט 1) התאגדות של פפטיד שנגזר חלבון היעד לתוך C-מסוף של eCPX, 2) יצירה של ספריית משנה של בירה על ידי נטייה לשגיאות PCR, 3) מבחר של חיידקים streptavidin-binding על ידי מיון תא מגנטי מופעל (מקינטוש), 4) קוונפיקציה של חיידקים העשרה, ו 5) האפיון הראשוני של שיבוטים מבודדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
באשר לכל שיטות הבחירה, החשיבות הרבה ביותר היא לשטוף את צעדי הכביסה. מאז חיידקים לא צריך להיות חומק מן החרוזים לפני הגברה של שיבוטים שנבחרו, כריכת זיקה גבוהה בין ביוטין ו streptavidin יכול לשמש במקום באמצעות avidins אהדה נמוכה, כפי שנעשה בעבר עם מערכת התצוגה phage, עבור מבחר משתני בירה7,</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למוחמד ליוהי אחמד על הסיוע של טכנאי מומחה. עבודה זו הייתה נתמכת על ידי מענקים מקרן לוננבק, קרן נובו נורדיסק, אגודת הכליות הדנית, קרן הכליה והDanielsen, הקרן לקידום מדעי הרפואה וקנוד ואדית אריקסן . קרן הזיכרון
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme’s Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
