البكتيريا الببتيد العرض لاختيار الانزيمات بيوتينيلاتينج رواية
Summary
هنا نقدم طريقه لتحديد المتغيرات الجديدة من e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا التي بيوتينيلات الببتيد الهدف محدده. يصف البروتوكول بناء البلازميد للعرض البكتيرية من الببتيد الهدف ، وتوليد مكتبه البيرا ، واختيار وتوصيف المتغيرات البيرا.
Abstract
البيوتين هو تعديل جذاب بعد الانتقالية للبروتينات التي توفر علامة قويه للعزل والكشف عن البروتين. الانزيميه الحيوية من قبل e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا هي محدده للغاية ويسمح للبيئة البروتينات المستهدفة في بيئتهم الاصليه. ومع ذلك ، فان الاستخدام الحالي للحيوية بوساطة البيرا يتطلب وجود الببتيد متقبل الاصطناعية (AP) في البروتين المستهدف. لذلك ، يقتصر تطبيقه علي البروتينات التي تم هندستها لاحتواء AP. والغرض من هذا البروتوكول هو استخدام العرض البكتيري من الببتيد المستمدة من البروتين المستهدف غير المعدلة لتحديد المتغيرات البيرا التي بيوتينيلات الببتيد. ويستند هذا النظام علي البلازميد واحد الذي يسمح للتعبير المشترك من المتغيرات البيرا إلى جانب سقالة للعرض الببتيد علي سطح البكتيريا. ويصف البروتوكول اجراء مفصلا لادراج الببتيد الهدف في سقالة العرض ، وإنشاء مكتبه البيرا ، واختيار المتغيرات الفعلية البيرا والتوصيف الاولي للمتغيرات البيرا المعزولة. ويوفر الأسلوب نظام اختيار فعاله للغاية لعزل المتغيرات البيرا الرواية التي يمكن استخدامها للتطور الموجهة المزيد من البروتينات البيوتين البروتينية التي تعكر البروتين الأصلي في الحلول المعقدة.
Introduction
بيوينيليشن من البروتين يخلق علامة قويه لعزله تقارب والكشف عنها. الانزيميه البروتين بيوتينييشن هو تعديل ما بعد الانتقالية محدده للغاية محفزه من قبل الاربطه البيوتين البروتين. و e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا هو محدده للغاية والحيوية covalylates فقط عدد محدود من البروتينات التي تحدث بشكل طبيعي في بقايا ليسين محدده1. ويتم حاليا تسخير مزايا البيره الحيوية المحفزة عن طريق دمج البروتين المستهدف مع الاصطناعية الصغيرة 15-الامينيه-حمض البيوتين متقبل (AP) الذي هو فعال بيوتينيلاتيد2 ويسمح لتحديدا عاليا و كفاءه في الجسم الحيوي وفي المختبر الحيوي من خلال التعبير المشترك أو أضافه البيرا3،4،5. علي الرغم من ان في الجسم الخارجي وفي المختبر البيره يحفز البيوتين-بروتين الربط هو استراتيجية جذابة لوضع العلامات ، ويقتصر تطبيقه علي العينات التي تحتوي علي البروتينات AP-تنصهر. والغرض من هذا الأسلوب هو تطوير المسوخ الجديدة من البروتينات البيوتين البروتيني التي بشكل انتقائي البروتينات غير المعدلة الاصليه ، التالي توسيع عدد التطبيقات التي يمكن استخدامها في استراتيجية الانزيميه الحيوية.
يمكن ان تتطور وظيفة البروتين من خلال جولات تكراريه من طفرة الجينات ، واختيار ، وتضخيم المتغيرات الجينات مع الوظيفة المطلوبة. استراتيجية اختيار قويه وفعاله أمر حاسم بالنسبة للتطور الموجهة ويتم اختيار النشاط البيوتين البروتين يغاز بسهوله بسبب الربط القوي بين البيوتين والسسترافالدين و homologs6. تكنولوجيات العرض phage تسمح لاختيار phage التي تعرض الببتيدات بيوتينيلاتيد7,8. وبما ان تضخيم الزوائد المعزولة يتطلب عدوي من المضيف البكتيري ، الا ان الاختيار الفاجي مع العقديات يخلق اختناقا في ان الربط العالي التقارب من البيوتين إلى العقديات لا رجعه فيه تقريبا في ظل عدم الفصل الظروف. لضمان ربط عكسها من phages الحيوية ، واستخدمت avidins موحودي مع تقارب اقل مما ادي إلى الإثراء ~ 10 اضعاف متواضعة7. طورنا مؤخرا طريقه عرض بكتيرية لعزل متغيرات البيرا الجديدة التي تلغي الحاجة إلى التملص من مصفوفة التقارب التالي تزيل اختناقا من أنظمه اختيار البيرا السابقة9. في الواقع ، لدينا نظام عرض البكتيرية يسمح لإثراء > 1 ، 000 ، 000 اضعاف من استنساخ النشطة في خطوه اختيار واحده9، التالي توفير نظام اختيار فعال للتطور الموجهة من المتغيرات البيرا الرواية.
لدينا نظام العرض البكتيري يتكون من اثنين من المكونات ، البيرا مع C-المحطة 6xHis العلامة والبروتين سقالة التي تسمح لعرض سطح الببتيد الهدف. استخدمنا البروتين سقالة معززه دائري الغشاء الخارجي البروتين X (eCPX) منذ عرض فعال من الببتيدات يمكن ملاحظتها في كل من N-و C-تيرميني10،11. الانصهار من الهدف الببتيد تسلسل إلى ال [ك-تيرمينوس] من [اكpx] يضمن [بيوينيلايشن] من جراثيم عبر عن نشطه [بيرا] [فرينت]. البكتيريا تسمح للاختيار العقديات فعاله كما الببتيد بيوتينيلاتيد يعرض الآن علي السطح (الشكل 1ا).
والغرض من هذا الأسلوب هو لتحديد المتغيرات الجديدة من البيرا التي بيوتينيلات الببتيد متواليات الموجودة في البروتينات الاصليه. يتم ترميز النظام من قبل الجينات الموجودة علي البلازميد pbad-البيرا-ecpx-AP ، الذي يحتوي علي مروج العربية المحرض السيطرة علي البيرا (arabad) ، ومروج T7 السيطرة ecpx9 (الشكل 1ب). يصف هذا البروتوكول الاجراء المفصل ل 1) دمج الببتيد المستمدة من البروتين المستهدف في C-الطرفية من eCPX ، 2) إنشاء مكتبه الداخلية من البيرا عن طريق الخطا المعرضة PCR ، 3) مجموعه من البكتيريا الملزمة العقديات من قبل فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MAC) ، 4) التحديد الكمي لإثراء البكتيريا ، و 5) التوصيف الاولي لمستنسخات معزولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
اما بالنسبة لجميع طرق الاختيار ، فان صرامة خطوات الغسيل ذات اهميه قصوى. وبما ان البكتيريا لا تحتاج إلى التملص من الخرز قبل تضخيم المستنسخين المختارين ، يمكن استخدام الربط العالي بين البيوتين والسسترافيدين بدلا من استخدام avidins التقارب الأقل ، كما فعلت سابقا مع نظام عرض بالعاثيه ، الانتقاء …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفان محمد عبد السيد احمد علي المساعدة الفنية الخبيرة. وكان هذا العمل مدعوما بمنح من مؤسسه لوندبيك ، ومؤسسه نوفو نورديسك ، وجمعيه الكلي الدانمركية ، ومؤسسه اياسي اوغ اجنار دانييلسن ، ومؤسسه A.P. مولر للنهوض بالعلوم الطبية ، وكود واياديث اريكسون مؤسسه ميموريال.
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme’s Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
