JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği

Published: November 26, 2019
doi:
10.3791/60256
, , , , ,
1Department of Experimental Oncology, IEO,European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hemato-Oncology,University of Milan

Summary

Burada, in vitro mammosphere öz-yenileme nicel tahsin sonuçlarının uygulanması ve yorumlanması açıklanmaktadır.

Abstract

Meme bezi geniş rejenerasyon kapasitesi ile karakterizedir, bir kadının yaşam döngüsü boyunca büyük hormonal değişiklikler geçer gibi. Meme kök hücrelerinin (MASC) rolü hem fizyolojik/gelişimsel bağlamda hem de meme kanserinegenezi açısından yaygın olarak incelenmiştir. Bu açıdan, MaSC özelliklerine odaklanan ex vivo çalışmaları çok sonra aranır. Mammosphere kültürleri organ oluşumunun bir taşıyıcısı temsil ve hem temel hem de çevirisel araştırma için değerli bir araç haline gelmiştir. Burada, murine primer mamografi kültürleri ve MaSC büyüme özelliklerinin niceliği için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokol, meme bezi toplama ve sindirimi, primer meme epitel hücrelerinin (MECs) izolasyonunu, primer mammosfer kültürlerinin kurulmasını, seri geçişleri, mammosfer büyüme parametrelerinin niceliğini ve sonuçların yorumlanmasını içerir. Örnek olarak, düşük seviyeli kurucu Myc ifadesinin normal MEC’ler üzerindeki etkisini sunarak artan kendini yenileme ve çoğalmaya yol açıyoruz.

Introduction

Meme epitel sapı ve ata hücrelerinin izolasyon ve in vitro kültürü meme hücre biyolojisindeki özelliklerini anlamak için gerekli hale gelmiştir. Zarif soy izleme ve seri transplantasyon tahlilleri, in vivo niş bağlamında kök hücre (SCs) ve diğer doku alt kümelerinin incelenmesini sağlamıştır. Ancak, bu yaklaşım zaman alıcı ve muhabir fare modelleri1,2,3,4,5nesil gerektirir. Bu nedenle, in vitro kültür ve meme kök hücrelerinin yayılması (MASCs) anahtar köklük özellikleri, yani kendini yenileme ve farklılaşma yeteneği, bu alanda en büyük zorluklardan biridir. Son yıllarda, mammosphere testi yaygın normal meme dokusu ve meme kanseri büyüme modeli için, normal veya kanser SCs (CCs) ölçmek ve kendi faaliyetlerinin bir vekil muhabiri olarak kendi kendini yenileme yeteneğini değerlendirmek için kullanılmıştırvivobağlamda kendi faaliyetlerinin bir vekil muhabiri olarak 6,7,8,9,10,11.

Mammosphere tsay verimli ve maliyet-etkin bir yaklaşımdır, hangi taze izole meme epitel hücreleri (MECs) non-yapışık koşullarda kültürlü olan, sadece MASCs hayatta kalacak ve süspansiyon küreler oluştururken tüm diğer hücre tipleri anoikis tarafından ölecek. Ayrıca, seri non-adherent pasajlarda mammospheres birkaç nesil oluşturmak için yeteneği MaSCs6,9,11kendi kendini yenileme yeteneği ile ilgilidir. Burada, başlangıçta Dontu ve meslektaşları7 öncü nörosfer tahlili bir değişiklik olarak geliştirilen bir nicel mammosphere tahsin ayrıntılı bir protokol açıklar12, uygun büyüme faktörlerinin eklenmesi ile non-adherent, serum-free koşullarda putatif SC büyümesini sağlayan7,12.

Protocol

In vivo işlemler AB direktifi 2010/63 ve kurumsal etik komitesi (Hayvan Sağlığı için Organizma-OPBA) ve İtalya Sağlık Bakanlığı (IACUC Numaraları 762/2015 ve 537/2017) onayı sonrasında gerçekleştirilmiştir. 1. Murine Meme Bezi Toplama ve Sindirim Tipik bir deney için, CO2 teneffüs tarafından 8-10 haftalık bakire dişi fareler kurban. Deneyin amaçlarına bağlı olarak 5-30 fare kullanın. Fareleri bir kaputun altına diseksiyon tahtalarına yerleştirin. Ön ayakları germek ve etanol ile hayvanın kürk aşağı yıkamak için iğnekullanın. Forseps ile cildi kaldırın ve pelvik alan düzeyinde başlayan ve serviks e kadar tüm yol hareket dikey bir kesi gerçekleştirmek, periton bozulmadan bırakarak. Cilt veya periton yırtılma önlemek için, yuvarlak kenarlı makas kullanın. Dikkatle vücudun lateral ekseni boyunca makas nazik hareketleri ile vücuttan cilt ayırmak. Deri torasik ve karın bölgesinden tamamen ayrıldıktan sonra, hayvanın dört uzuvları boyunca dört kesi yapın ve iğnelerle deriyi sabitler. Tam genişletilmiş deri den hayvanın vücut ayırmak için makas ve forceps kullanın. Yavaşça şimdi tamamen maruz ve dikkatle makas yardımı ile deriden ayırmak meme yağ pedleri kaldırmak için forseps kullanın. Her farenin alt torasik ve abdominal meme bezlerini toplayın ve 50 mL konik tüpiçinde Dulbecco’nun fosfat tamponlu salinine (DPBS) batırın. Tüp başına en fazla 20 bez toplayın. Dokuları buzda tut.NOT: Gerekirse, bezleri bir gecede buz üzerinde kalabilir. Burası güvenli bir durak noktası. Aşağıdaki adımlar steril koşullar altında yapılmalıdır. Sindirim ortamını hazırlayın ve filtreleyin: Dulbecco’nun modifiye kartal ortası (DMEM) 2 mM glutamin, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 200 U/mL kollajenaz ve 100 μg/mL hyaluronidaz (Malzeme Tablosunabakınız). 100 mm Petri kabına 20 beze aktarın ve neşter veya kavisli makas kullanarak dokuyu dolayın. Büyük hacimlerde DPBS’yi yemeğe aktarmaktan kaçının. Her Petri kabına 10 mL sindirim ortamı ekleyin ve 25 mL serolojik pipet kullanarak kıyma dokusunu 50 mL konik bir tüpe aktarın. Tüpleri parafilm ile kapatın ve bir rotator üzerine yerleştirin. Rotatörü düşük hızda (0,03 x g)ayarlayın ve %5 CO2içeren nemli bir atmosferde 37 °C’de 2,5 saat kuluçkaya yatırın. Sonraki adımlara geçmeden önce süspansiyonu görsel olarak inceleyin. Büyük doku parçaları sindirilmemiş kalırsa, kuluçka süresini 37 °C’de 30 dakika daha uzatın.NOT: Alternatif olarak, sindirim bir gecede yapılabilir 37 °C, 5% CO2, nazik bir kollajenaz / hyaluronidase enzim karışımı kullanılarak13. 2. Birincil Murine MECs Izolasyon Rotatörü durdurun ve tüpleri kuvözden çıkarın. 5 mL serolojik pipetin açılışında p1000 ucunu ayarlayın. Süspansiyon P1000 ucundan geçerse, sonraki adımlara devam edin. Aksi takdirde, 37 °C’de kuluçka süresini 30 dakika daha uzatın. Santrifüj 100 x g, 4 °C’de 5 dk. Supernatant’ı dikkatlice decant ve her tüpün peletini 3 mL DPBS’de yeniden askıya alın.NOT: Düşük santrifüj hızı lenfositler ve yağ dokusu hücrelerinin kaldırılmasını sağlar. Bu adımda peletin sislodging önlemek için nazik manipülasyon gereklidir. 100, 70 ve 40 μm hücreli süzgeçkullanarak her tüpteki hücre süspansiyonuna ayrı ayrı süzün. Her filtreleme adımında, geçişi toplamadan önce süzgeçleri 2 mL DPBS ile yıkayın.NOT: Bu noktadan itibaren, hücre süspansiyonları biraraya getirilebilir ve birlikte işlenebilir. Santrifüj 300 x g, 4 °C’de 5 dk. Supernatant’ı dikkatlice decant ve DPBS’nin kalan hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın. Eşit hacimde amonyum-klorür-potasyum (ACK) lysis tamponu ekleyerek kırmızı kan hücresine (RBC) devam edin (Bkz. Malzemeler Tablosu). Pipetleme ile karıştırın ve 5 dakika kadar buz üzerinde kuluçka. 4 °C’de 5 dk için 300 x g’de10 mL DPBS ve santrifüj ekleyin. Supernatant’ı dikkatlice dekatant ve peleti görsel olarak inceleyin. Pelet beyazsa, bir sonraki adıma geçin. Aksi takdirde RBC lysis adımını tekrarlayın (adım 2.5). Mammosphere media 1-5 mL hücre pelet resuspend: meme epitel hücre büyüme bazal orta (MEBM), 2 mM glutamin ile takviye, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 5 g/mL insülin, 0.5 μg/mL hidrokortizon, %2 B27, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 20 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve 0.4 IU/mL heparin (Tablo Malzemeler) 3. Seri Mammosphere Re-kaplama Mammosfer kültürlerinin kurulması için, hücreleri mamografi mecrasında 200.000 canlı hücre/mL yoğunlukta tedavi edilen doku dışı kültüre (ultra-düşük yapışma) 6-iyi plakalar üzerine plakalayın. Hücreleri 37 °C,%5 CO2’de7-10 gün kuluçkaya yatırın. etanolde %1 poli-HEMA çözeltisi hazırlayın ve filtreleyin (bkz. Malzemeler Tablosu). Aşağıdaki pasajlar için ultra düşük yapışma 6-iyi plakalar katlayın, kuyu başına 400 μL poli-HEMA çözeltisi ekleyerek ve etanolün tamamen kurumasını sağlayarak. Daha iyi sonuçlar elde etmek için kaplamayı iki kez tekrarlayın.NOT: İlk geçiş sırasında kaplamasız plakaların kullanılması fibroblastların kültürden seçici olarak çıkarılmasını sağlar. 7-10 günlük kültürün sonunda, tüm kuyulardan birincil mammospheres toplamak ve santrifüj 300 x g, 4 ° C’de 5 dakika için. Supernatant’ı dikkatlice dekantın ve filtreli uçlu P200 pipeti kullanarak mammospheres’in mekanik ayrıştırılmasına devam edin. Pipet yaklaşık 100 kez ve görsel olarak büyük küresellerin varlığı için süspansiyon incelemek.NOT: 37 °C’de düşük hacimli (0.2-0.5 mL) küre peletinin kısa bir kuluçka (2-5 dk) veya %5 CO2,mekanik dissosiasyonu kolaylaştırmak için kullanılabilir. Her pasajın kaplaması için taze mammosphere orta (adım 2.7) hazırlayın. Taze mamografi orta 1-5 mL resuspend ve canlı hücreleri saymak. Varsa, tedavi gruplarında veya kültür koşullarına hücreleri bölün. Plaka 20.000 canlı hücre /mL poli-HEMA kaplı ultra-düşük yapışma 6-iyi plakalar ve kuluçka 37 °C, 5% CO2.NOT: Mamospheres hücre kaplama sonra 5-7 gün içinde maksimum boyutuna ulaşır. Mümkün olduğunda, teknik çoğaltmalar elde etmek için her örnek veya koşulun hücrelerini birden çok kuyuya dağıtın. Hücre agregasını önlemek için kaplama yoğunluğu düşük tutulmalıdır. 6-iyi plakalar için maksimum 20.000 hücre/mL ve 24 kuyulu plakalar için 5.000 hücre/mL önerilir. 5-7 gün sonra, iyi başına küre sayısını saymak. Bu, 10x büyütme lensi ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak veya dijital görüntü analizi kullanılarak manuel olarak yapılabilir (bkz. adım 4). Her kuyunun mamospheres ayrı ayrı toplayın ve santrifüj 300 x g, 4 °C’de 5 dakika için. Supernatant’ı dikkatlice dekantın ve filtreli uçlu P200 pipeti kullanarak mammospheres’in mekanik ayrıştırılmasına devam edin. Pipet yaklaşık 100 kez ve görsel olarak büyük küresellerin varlığı için süspansiyon incelemek. Taze mammosphere orta 1 mL resuspend ve canlı hücreleri saymak. Her numunenin veya koşulun hücrelerini birleştirin ve 3.6-3.10 adımlarını yineleyin. Kaplanmış hücre sayısını ve her geçit için her biri için sayılan küre ve hücre sayısını kaydedin. Kümülatif büyüme hesaplaması için adım 5’e geçin. 4. Dijital Görüntü Analizi (DIA) Kullanarak Küre Numaralandırma Her pasajın sonunda, tüm kuyuların tüm yüzeyini tarayıp stereoskopüzerine monte edilmiş bir dijital kamera kullanarak kürelerin görüntülerini elde edin. Görüntüleri .tif dosyaları olarak kaydedin. ImageJ14’ükullanarak stereoskop görüntülerini Görüntü Dizisi olarak aktarın. Ölçeği ve görüntü türünü 8 bit olarak ayarlayın. Resim yığınını çoğaltın ve menü çubuğundaki sekme işleminden Arka Planı Çıkar’ı seçin. Seçenekleri kontrol Edin Işık arka plan ve Kayan paraboloid ve düğmesinetıklayın Tamam . Yığının tüm görüntülerini işle. Menü çubuğunun sekmesinden Ayarla ve Ardından Eşik’i seçin. Uygula’yatıklayarak, Yığını İkiliye Dönüştür başlıklı bir diyalog penceresi görüntülenir. Yöntem olarak Varsayılan’ı ve arka plan olarak Işık’ı seçin. Kutuyu işaretle Her görüntü için hesapla eşiğini hesapla ve Tamamdüğmesine tıklayın. Menü çubuğunun sekmesinin altındaki İkili listeden Havza, Aç ve Erode komutlarını sırayla seçin. Görünen diyalog kutusunun Evet düğmesine tıklayarak yığının tüm görüntülerini işleyin.NOT: Bu işlemler, nesnelerin dokunması, nesnedüzitme ve nesnelerin kenarından piksel kaldırma görsel bölümleme sağlar. İşlevçözümme menüsünden Parçacıkları Analizet’i seçin. Minimum boyut eşiğini 10.000 μm2 ve 0,50 ile 1,00 arasında dairesellik olarak ayarlayın. Açılan menüden Elips seçeneğini seçin. Özetle’yiişaretleyin , kenarlarda hariç tut ve yerinde Göster ve Tamamdüğmesine tıklayın. Yığının tüm görüntülerini işle. Elipslerin kürelerle olan yazışmalarını görsel olarak inceleyin ve gerekirse parçacık sayısını buna göre düzeltin. Her kuyunun tüm karelerinden sayımları toplamı, her kuyunun toplam mammospheres sayısını elde etmek için. 5. Kümülatif Büyüme Eğrisi Hesaplama NOT: Her pasajın sonunda her kuyuda sayılan mammospheres sayısı (PN)PNbaşında tohumlanmış mammosphere başlatan hücrelerin sayısını yansıtır. Her geçiş için (PN),kaplamalı hücre sayısını ve iyi başına sayılan hücre ve küre sayısını kaydedin. Her pasajın sonundaki küre boyutunu hesaplayın:küre boyutu PN (hücre / küre) = pn / küre sayılanp n sayılan hücrelerNOT: PN’deki küre boyutu, PN’detohumlanan her mammosferbaşlatan hücrenin proliferatif potansiyelinin bir ölçüsüdür. PN için kaplanmış hücre sayısını bir önceki pasajın sonunda hesaplanan küre boyutuna bölerek kaplamalı kürelerin sayısını çıkar (PN-1):küreler pN = hücreleri pn / küre boyutu PN-1 kaplamaNOT: Konvansiyona göre, küre boyutu kültürün ilk geçişi sırasında kararlı kabul edilir (yani, küre boyutu P0 = küre boyutu P1). Birden çok kuyu teknik çoğaltma olarak kullanılıyorsa, PN-1’deki ortalama küre boyutunu payda olarak kullanın. Her geçit için kümülatif hücre ve küre numarasını hesaplayın:kümülatif sayı PN = (pn / kaplamaLı PN)X kümülatif sayı PN-1.NOT: Konvansiyona göre, kümülatif sayı P0 = p1plakalı . Teknik çoğaltma olarak birden çok kuyu kullanılıyorsa, her geçiş için numune veya koşul başına ortalama kümülatif sayıyı hesaplayın. Veri noktalarını yarı logaritmik ölçekte çizin. Geçiş numarasını (P0-P N)x ekseninde (doğrusal ölçek) ve y ekseninde kümülatif hücre veya küre numarasını (logaritmik ölçek) görüntüleyin. Üstel bir eğilim çizgisini veri noktalarına sığdırın ve uyumun iyiliğini ölçmek için belirleme katsayısını (R2)hesaplayın.NOT: Veri noktalarına takılan eğilim çizgisi, sabit bir hızda büyüyen veya ölen bir hücre popülasyonu için beklendiği gibi üstel bir eğriye yaklaşmalıdır. R2, 0 ile 1 arasındaki değerleri alır ve 1’e en yakın değerler daha iyi bir uyum gösterir. Kültürün büyüme hızını (GR) çıkarmak için eğilim çizgisinin denklemini doğal bir üstel işlev olarak gösterin:y = y0 e(GR)x, y0 değeri ise y = 0 olur.

Representative Results

Normal MECs MYC aşırı ekspresyon, mammosphere başlatan hücrelerin artan sıklığı yol açar. Bu çift mekanizma ile elde edilir: Myc MaSC simetrik bölünmeler ve yeni MASCs11içine progenitor yeniden programlama sıklığını artırır. Düşük kurucu Myc ekspresyonunun etkisini test etmek için, Myc aktivitesinin 4-hidroksitamoksifen (4-OHT)tarafındanindüklenebileceği Rosa26-MycER transgenik fare modelini kullandık. 4-OHT yokluğunda, fibroblastları çıkarmak için ilk olarak MEC’leri ultra düşük yapışma 6-iyi plakalara yapıştırdık. İlk pasajdan sonra kültürü ikiye böldük: iki kuyu tedavi edilmedi (kontrol) ve iki kuyu 200 nM 4-OHT (MycER) ile tedavi edildi. Üç bağımsız deney için 5 ardışık pasajın küre ve hücre numaralarını saydık(Tablo 1). Her geçitteki kümülatif hücre ve küre sayıları Tablo 2’degösterilmiştir. 4-OHT ile indüksiyon, Şekil 1’degösterildiği gibi küre ve hücre büyüme oranlarının artmasına yol açar. Şekil 1: Temsili sonuçlar. Kümülatif küre (A) ve hücre (B) kontrol ve MycER mammospheres büyüme eğrileri. 3 bağımsız deneyin ortalama ve standart sapması gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 1. kaplama 2. kaplama 3. kaplama 4. kaplama 5. kaplama Kaplanmış Hücreler Hücre Sayısı Küre Sayısı Kaplanmış Hücreler Hücre Sayısı Küre Sayısı Kaplanmış Hücreler Hücre Sayısı Küre Sayısı Kaplanmış Hücreler Hücre Sayısı Küre Sayısı Kaplanmış Hücreler Hücre Sayısı Küre Sayısı Exp1 Denetim 77,000 50,000 31 65,000 58,500 41 57,000 30,000 32 30,000 22,000 5 22,000 0 0 77,000 81,000 41 65,000 55,000 23 MycER 77,000 31,0000 193 80,000 375,000 323 80,000 380,000 217 80,000 220,000 223 80,000 170,000 155 77,000 110,000 142 80,000 505,000 396 80,000 270,000 149 80,000 290,000 194 80,000 250,000 160 Exp2 Denetim 75,000 75,000 71 60,000 17,000 34 28,000 45,000 29 45,000 13,000 2 13,000 0 0 75,000 47,000 45 60,000 11,000 47 MycER 75,000 200,000 188 80,000 225,000 277 80,000 230,000 155 80,000 210,000 211 80,000 100,000 95 75,000 250,000 192 80,000 202,500 283 80,000 305,000 185 80,000 160,000 237 80,000 100,000 133 Exp3 Denetim 82,500 130,000 121 80,000 45,000 105 80,000 110,000 86 80,000 58,500 75 58,500 58,500 78 82,500 125,000 177 80,000 71,250 42 MycER 82,500 325,000 457 80,000 610,000 327 80,000 367,000 309 80,000 500,000 260 80,000 115,000 146 82,500 475,000 463 80,000 455,000 392 80,000 415,000 204 80,000 470,000 295 80,000 185,000 161 Tablo 1: Her geçitte sayılan küre lerin sayısı ve kaplanmış ve sayılan hücre sayısı. Tablo 2: Kaplamalı küre numaraları ile kümülatif küre ve hücre numaralarının hesaplanması. Bu tablonun daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Discussion

Burada, masc büyüme özelliklerinin in vitro nicel tanımı için bir protokol açıklıyoruz. Örnek olarak, düşük seviyeli kurucu Myc ifadesinin normal murine MASC’ler üzerindeki etkisini sgörüyoruz. Ancak bu yaklaşım çeşitli bağlamlara eşit olarak uygulanabilir. İnsan veya murine birincil hücreleri, hem de kurulan hücre hatları, seri olarak geçilebilir mammosfer kültürleri kurmak için ankraj bağımsız koşullarda kültürlenebilir. Gen aşırı ekspresyonu ve RNA paraziti protokole ilk geçişin sonunda viral bir transdüksiyon adımı eklenmesiyle (3.5. adımdan sonra) kolayca sunulabilir. Alternatif olarak, hücreler yapışma enfekte olabilir ve daha sonra mammospheres olarak kaplanmış.

Burada sunulan tahmin kritik bir yönü, sonuçların yorumlanması na müdahale agregaların nesil önlemek için yeterince düşük olmalıdır tohumlama hücre yoğunluğu vardır16,17. Mammospheres morfolojisi bu belirsizliği gidermek için bilgilendirici olabilir. Sadece kompakt, yuvarlak küreler her pasajın sonunda numaralandırılmalıdır. Hem küresellerin daireselliği hem de boyutu göz önünde bulundurulmalıdır. DIA’nın otomatik leştirilmiş işlemi kullanılarak, bu adım uygun eşiklerle objektif ve mutlak bir şekilde sağlanır. Genellikle, ataları mamosfer sayımları dışında tutulmalıdır acinar yapılar veya hücrelerin daha küçük kümeleri oluşturacaktır. Başparmak kuralı olarak, 100 μm çapında bir eşik kullanırız. Son olarak, sağlam veya tamamen ayrıştırılmış olmayan mammopsheres bir pasajdan diğerine transferi önlemek için dikkatli olmalıdır. Öte yandan, aşırı pipetleme artan hücre ölümüne yol açacaktır. Bu nedenle, bu tür zorluklarla karşılaşılırsa, hafif tripsinizasyon veya Accutase tedavisi kullanmanızı ve tek hücreli süspansiyonların oluşmasını sağlamak için ayrık küreleri 40 μm’lik bir süzgeçten geçirmenizi öneririz.

Küre şekillendirme verimliliği (SFE) alternatif olarak, mammosphere kültürlerde SC veya CSC quantitation ex vivo için bir vekil olarak kullanılmıştır. SFE gerçekten belirli bir hücre popülasyonundaki kök benzeri hücrelerin bir ölçüsüdür. Ancak, yalnızca farklı zaman noktalarında bilgi sağladığından daha az vicdanlı bir yaklaşımı temsil eder. Bunun yerine, kümülatif küre sayılarının hesaplanması ve kümülatif büyüme eğrilerinin üretilmesi, kültürün ilk hücre tohumlama adımından kültür tükenene kadar ya da ölümsüzleştirilmiş kültürlerde istenilen sayıda geçit için kültür büyüme hızının çıkarımını sağlar. Büyüme özelliklerinin değerlendirilmesi, katsayı R2 ile üstel büyümeden sapmanın değerlendirilmesine ve ikinci adımda GR değerinin kendisinin değerlendirilmesine olanak sağlar.

Daha da önemlisi, kümülatif mammosfer büyüme eğrileri csc düzeyinde seçici küçük molekül inhibitörleri veya diğer kemoterapötik ilaçların etkisini değerlendirmek için kullanılabilir6,11. 5-7 pasajda fonksiyonel olarak egzoz normal primer mammospheres aksine, tümör mammospheres süresiz olarak genişletmek eğilimindedir. Bu özellik sınırsız CSC kendini yenileme yeteneği ile bağlantılıdır. Proliferasyon ve CSC kendini yenileme üzerindeki etkileri tümör hücresi ve mammosphere büyüme eğrileri üretimi ile uncoupled olabilir, sırasıyla. Bir CSC özgü etkisi kümülatif mammosphere büyüme hızında bir azalmaya neden olması bekleniyor, veya kümülatif hücre büyüme hızı üzerinde etkisi olmadan6,11.

Son olarak, ilgi başka bir alan yetişkin doku SC yeniden programlama biridir. Tam olarak yetiştirilen mammospheres bir fenotipik heterojen hücre popülasyonu oluşur, hangi sadece küçük bir kesir kök benzeri özellikleri korur, vivo nakli üzerine mammosphere başlatma yeteneği ve meme bezi rejenerasyonu da dahil olmak üzere6,9,11,18,19. Meme ataları böylece ya in vitro etiket istinat tahlilleri kullanılarak izole edilebilir6,9,11 veya, ex vivo, kurulan yüzey belirteçleri kullanarak2,3. Özellikle, meme ataları anoikis hayatta değildir ve mammospheres oluşturmak mümkün değildir. Zorunlu Myc ifade meme ataları PKHneg olarak izole mammosphere inisiyasyon potansiyeli vermek için gösterilmiştir11, süresiz olarak geçilebilir bir kültürün nesil sonuçlanan. Benzer şekilde, fizyolojik yeniden programlama negatif düzenleyicilerin girişim aynı test kullanılarak test edilebilir. Bu bağlamda, ortaya çıkabilecek ortak bir sorun hücre girişi sınırlı sayıda. Hücre girişi 10.000 hücreden daha düşükse, 24 kuyulu tabaklarda (maksimum 5.000 canlı hücre/mL) tohumlamanızı öneririz. Bununla birlikte, ankraj bağımsız kültür koşulları, özellikle yeniden programlama etkisi hemen olmadığı durumlarda, yeniden programlama puanlama için çok sert olduğu kanıtlanabilir. Bu gibi durumlarda, destekleyici bir matris ve 3 boyutlu organoid kültürlerin kullanımı daha uygun olabilir20.

Genel olarak, mammosphere test kolayca normal ve tümöral MEC popülasyonlarında kök benzeri özellikleri puanlama için istihdam edilebilir maliyet-etkin bir seçenektir. Bu protokolde alınan nicel yaklaşım, farklı koşullarda veya farklı uyaranlara maruz kalan kültürler arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırır. Titizlikle takip edildiğinde, daha ayrıntılı mekanistik çalışmalar imkanı sunan, in vivo kök özellikleri tanımlayan birden fazla oyuncu ayrılmasına izin veren nispeten basit bir ex vivo model sistemi sağlar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Rosa26-MycER transgenik fare modeli tür hediye için Bruno Amati teşekkür ederiz. Bu çalışma WWCR, AIRC, ERC ve İtalya Sağlık Bakanlığı’ndan P.G.P. T.V. ve X.A.’ya verilen hibelerle finanse edilmiştir.

Materials

ACK lysis buffer Lonza 10-548E Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL.
B27 Invitrogen 17504-044 B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v.
bFGF Peprotech 100-18B Human recombinant fibroblast growth factor – basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v.
Collagenase Sigma C2674 Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v.
DMEM Lonza 12-614F Dulbecco's modified Eagle's medium
DPBS Microgem S17859L0615 Dulbecco's phosphate buffered saline
EGF Tebu-Bio AF-100-15 Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v.
Glutamine Lonza 17-605E L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v.
Heparin PharmaTex 34692032 Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v.
Hyaluronidase Sigma H4272 Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v.
Hydrocortisone Sigma H0888 Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v.
Insulin SAFCBiosciences 91077C Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v.
Low attachment 6-well plates Corning 351146 Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid.
MEBM Lonza CC-3151 Mammary epithelial cell growth basal medium
Penicllin-Streptomycin mixture Lonza 17-602F Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v.
Poly-HEMA Sigma P3932 Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  2. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  3. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  4. van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland. Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).
  5. Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).
  6. Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).
  7. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  8. Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).
  9. Pece, S., et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140 (1), 62-73 (2010).
  10. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  11. Santoro, A., et al. p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value. Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).
  12. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  13. Gao, H., et al. Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters?. Springerplus. 5, 140 (2016).
  14. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  15. Murphy, D. J., et al. Distinct thresholds govern Myc’s biological output in vivo. Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).
  16. Bailey, P. C., et al. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 8, 29-39 (2018).
  17. Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  18. Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment. PLoS One. 6 (11), (2011).
  19. Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
  20. Panciera, T., et al. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).

Tags

Mammosphere CultureSelf-renewalBreast Stem CellsQuantificationCell CultureCell IsolationCell CountingCell LysisUltra-low AdhesionPrimary Mammosphere Formation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Vlachou, T., Aobuli, X., D’Elia, E., Santoro, A., Moroni, M. C., Pelicci, P. G. Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures. J. Vis. Exp. (153), e60256, doi:10.3791/60256 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image