JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Количественная оценка самообновления в культурах Murine Mammosphere

Published: November 26, 2019
doi:
10.3791/60256
, , , , ,
1Department of Experimental Oncology, IEO,European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hemato-Oncology,University of Milan

Summary

Здесь мы описываем реализацию и интерпретацию результатов количественного анализа самообновления in vitro mammosphere.

Abstract

Мэммарийская железа характеризуется обширной способностью регенерации, так как она проходит через массивные гормональные изменения на протяжении всего жизненного цикла самки. Роль стволовых клеток молочной железы (МАМ) широко изучается как в физиологическом/развитом контексте, так и в отношении канцерогенеза молочной железы. В этом аспекте, ex vivo исследования сосредоточены на Свойства MaSC высоко ценится. Маммосферные культуры представляют собой суррогат образования органов и стали ценным инструментом как для фундаментальных, так и для трансляционных исследований. Здесь мы представляем подробный протокол для генерации муриновых первичных маммосферных культур и количественной оценки свойств роста MaSC. Протокол включает в себя сбор и пищеварение молочных желез, изоляцию первичных эпителиальных клеток молочной железы (МЭс), создание первичных маммосферных культур, серийное прохожее, количественную оценку параметров роста маммографии и интерпретацию результатов. В качестве примера мы представляем влияние низкоуровневого составного выражения Myc на нормальные МЭК, что приводит к усилению самообновления и распространения.

Introduction

Изоляция и культура in vitro эпителиального стебля молочной железы и клеток-прародителей стали необходимыми для понимания их свойств в биологии клеток молочной железы. Элегантный отслеживание линии и серийные анализы трансплантации позволили изучить стволовые клетки (SCs) и другие подмножества тканей в контексте их in vivo ниши. Тем не менее, этот подход занимает много времени и требует генерации модели мыширепортера1,2,3,4,5. Таким образом, культура in vitro и распространение стволовых клеток молочной железы (MaSCs) при одновременном сохранении ключевых особенностей стебля, а именно самообновления и дифференциации способности, является одной из самых больших проблем в этой области. В последние годы, маммосферный анализ был широко используется для моделирования как нормальные ткани молочной железы и рака молочной железы роста, для количественной оценки нормального или рака SCs (CSCs) и оценить их самообновления способность в качестве суррогатного репортера их деятельности в их соответствующих в контексте vivo6,7,9,10,11.

Маммография является эффективным и экономически эффективным подходом, в котором свежеизолированные эпителиальные клетки молочной железы (MECs) культивируются в условиях неприсоединения, с предпосылкой, что только MaSCs выживут и образуют сферы в подвеске, в то время как все другие типы клеток умрут от anoikis. Кроме того, способность формировать несколько поколений маммосфер в серийных неприсоединения проходов связано с самообновлениеспособности MaSCs6,9,11. Здесь мы описываем подробный протокол количественного маммосферного асссея, который был первоначально разработан Донту и коллегами7 как модификация новаторского нейросферного асссса12, что позволяет рост прогнозных SCs в неприсоединения, без сывороточных условиях с добавлением соответствующих факторов роста7,12.

Protocol

Процедуры In vivo были выполнены в соответствии с директивой ЕС 2010/63 и после одобрения нашего комитета по институциональной этике (Организм по благополучию животных – OPBA) и Министерства здравоохранения Италии (IACUC Numbers 762/2015 и 537/2017). 1. Murine Mammary Gland Коллекция и пищеварение Для типичного эксперимента, жертву8-10 недель девственной самок мышей co2 ингаляции. В зависимости от целей эксперимента используйте 5-30 мышей. Поместите мышей на вскрытие доски под капотом. Используйте иглы, чтобы растянуть передние конечности и запивать мех животного этанолом. Поднимите кожу щипками и выполните вертикальный разрез, начиная с уровня тазовой области и двигаясь вплоть до шейки матки, оставляя перитонеум нетронутым. Чтобы избежать разрыва кожи или перитонеума, используйте ножницы с круглыми краями. Тщательно отсоедините кожу от тела нежными движениями ножниц по боковой оси тела. После того, как кожа полностью отделена от грудной клетки и брюшной области, выполнить четыре разреза через четыре конечности животного и приколоть кожу с иглами. Используйте ножницы и щипцы, чтобы полностью отделить тело животного от удлиненой кожи. Используйте щипцы, чтобы аккуратно поднять молочные жиры прокладки, которые в настоящее время полностью подвергаются и тщательно отсоединить их от кожи с помощью ножниц. Соберите нижнюю грудную и брюшную молочные железы каждой мыши и погрузите их в фосфатный солей Dulbecco (DPBS) в коническую трубку мощностью 50 мл. Соберите до 20 желез на трубку. Держите ткани на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости железы могут оставаться на льду на ночь. Это безопасная остановка. Следующие шаги должны выполняться в стерильных условиях. Подготовка и фильтрация среды пищеварения: Dulbecco в модифицированных Eagle в среде (DMEM) дополнен2 мм глутамина, 100 U/mL пенициллин, 100 мкг /мЛ стрептомицин, 200 U /mL коллагеназы и 100 м/мл г/м. гиал гиуронидаза (см. Перенесите до 20 желез в тарелку Петри на 100 мм и фарш из ткани с помощью скальпеля или изогнутых ножниц. Избегайте переноса больших объемов DPBS на блюдо. Добавьте 10 мл среды пищеварения к каждой чашке Петри и перенесите измельченные ткани в коническую трубку 50 мл, используя серологический пипетку мощностью 25 мл. Запечатайте трубки парафильмом и поместите их на ротатор. Установите ротатор на низкой скорости (0,03 х г)и инкубировать на 2,5 ч при 37 градусов по Цельсию во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Визуально осматривайте подвеску, прежде чем перейти к следующим шагам. Если крупные части ткани остаются непереваренные, продлите инкубацию на уровне 37 градусов еще на 30 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, пищеварение может быть выполнено в одночасье при 37 КС, 5% CO2, используя нежный коллагеназы / гиалуронидаза фермента смеси13. 2. Изоляция первичных Murine MECs Остановите ротатор и удалите трубки из инкубатора. Отрегулируйте наконечник P1000 при открытии серологического пипетки 5 мл. Если подвеска проходит через наконечник P1000, перейдите к следующим шагам. В противном случае, продлить инкубацию на 37 градусов еще на 30 мин. Центрифуга при 100 х г,в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Тщательно освятить супернатант и resuspend гранулы каждой трубки в 3 мл DPBS.ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая скорость центрифугирования позволяет удалить лимфоциты и жировые клетки тканей. Нежные манипуляции необходимы, чтобы избежать вытеснения гранулы на этом этапе. Фильтр клеточной подвески в каждой трубке отдельно, используя 100, 70 и 40 мкм ячейки ситектов. На каждом этапе фильтрации, мыть ситектов с 2 мл DPBS перед сбором прохода.ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента суспензии ячейки могут быть объединены и обработаны вместе. Центрифуга при 300 х г,в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Тщательно освятийте супернатант и resuspend клетки в оставшемся объеме DPBS. Приступить к красная кровь (РБК) лиза, добавив равный объем аммония-хлорид-калий (ACK) лиза буфера (см. Таблица материалов). Смешайте трубачом и инкубируйте на льду до 5 мин. Добавить 10 мл DPBS и центрифуги на 300 х г,в течение 5 мин при 4 C. Тщательно освятийте супернатант и визуально осмотрите гранулы. Если гранулы белые, перейдите к следующему шагу. В противном случае повторите шаг лиза РБК (шаг 2.5). Приостановить клеточные гранулы в 1-5 мл маммосферных носителей: маммарийская эпителиальная клетка роста базальной среды (МЭМБ), дополненная 2 мм глутамина, 100 U/mL пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицин, 5 мкг/мл инсулина, 0,5 мкг/мл гидрокортизона, 2% B27, 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 0,4 М./ 3. Серийное маммосферное повторное покрытие Для создания маммосферных культур, пластины клеток на не-ткани культуры лечение (ультра-низкая сливка) 6-коловидные пластины при плотности 200000 жизнеспособных клеток / мл в маммосфере среды. Инкубировать клетки в течение 7-10 дней при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. Подготовка и фильтрация 1% поли-HEMA раствор в 95% этанола (см. Таблица материалов). Пальто ультра-низкой адгезии 6-колодись пластин для следующих проходов, добавив 400 зл и 1% поли-HEMA раствор ау-ну и позволяет этанола полностью высохнуть. Для получения лучших результатов повторите покрытие дважды.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование непокрытых пластин во время первого прохода позволяет избирательно удалять фибробласты из культуры. В конце 7-10 дней культуры, собирать первичные маммосферы из всех скважин и центрифуги на 300 х г,в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию. Тщательно decant супернатант и приступить к механической диссоциации маммосфер с помощью пипетки P200 с фильтрованными советами. Пипетка примерно 100 раз и визуально осматривают подвеску на наличие крупных сфероидов.ПРИМЕЧАНИЕ: Короткая инкубация (2-5 мин) сферы гранул в низком объеме (0,2-0,5 мл) трипсина или аккутаза при 37 градусах Цельсия, 5% CO2,может быть использована для облегчения механической диссоциации. Приготовьте свежую маммосферную среду (шаг 2.7) для покрытия каждого прохода. Приготовь 1-5 мл свежей маммосферы среды и подсчитайте жизнеспособные клетки. Если это применимо, разделите клетки на лечебные группы или культурные условия. Плита 20,000 жизнеспособных клеток/мл на поли-HEMA покрытием ультра-низкой адгезии 6-колодец пластин и инкубировать при 37 КС, 5% CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Маммосферы достигают своего максимального размера в течение 5-7 дней после клеточного покрытия. Когда это возможно, распределите клетки каждого образца или состояния на несколько скважин, чтобы получить технические репликации. Плотность покрытия должна быть низкой, чтобы избежать агрегации клеток. Максимум 20 000 клеток/мл рекомендуется для 6-колодецных пластин и 5000 клеток/мл для 24-колодцев. Через 5-7 дней подсчитайте количество сфер на скважину. Это можно сделать либо вручную, с помощью микроскопа, оснащенного 10-x увеличенным объективом, либо с помощью цифрового анализа изображений (см. шаг 4). Соберите маммосферы каждого колодца отдельно и центрифугу при 300 х г,в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Тщательно decant супернатант и приступить к механической диссоциации маммосфер с помощью пипетки P200 с фильтрованными советами. Пипетка примерно 100 раз и визуально осматривают подвеску на наличие крупных сфероидов. Приготовь 1 мл свежей маммосферы среды и подсчитайте жизнеспособные клетки. Объедините клетки каждого образца или состояния и повторите шаги 3.6-3.10. Запишите количество покрых клеток и количество сфер и клеток, подсчитанных в скважине для каждого прохода. Приступить к шагу 5 для кумулятивного расчета роста. 4. Значение сферы с использованием анализа цифровых изображений (DIA) В конце каждого прохода сканировать всю поверхность всех скважин и получить изображения сфер с помощью цифровой камеры, установленной на стереоскопе. Сохранить изображения как файлы .tif. Импорт изображения стереоскопа как изображение последовательности с помощью ImageJ14. Установите масштаб и тип изображения на 8-битный. Дублируйте стек изображений и выберите вычесть фон из процесса вкладок в панели меню. Проверьте варианты Свет фон и раздвижные параболоид и нажмите на кнопку OK. Обработайте все изображения стека. Выберите Отрегулация, а затем Порог из вкладки Изображение панели меню. При нажатии на Applyпоявится окно диалога под названием Convert Stack to Binary. Выберите по умолчанию как метод и свет в качестве фона. Проверьте порог расчета коробки для каждого изображения и нажмите на кнопку OK. Выберите последовательно команды Watershed, Open и Erode из двоичного списка под вкладкой Процесс панели меню. Обработайте все изображения стека, нажав на кнопку Да в поле диалога, которое появляется.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти процессы позволяют визуально сегментировать объекты, которые касаются, объект сглаживает и удаляет пикселей от края объектов. Выберите функцию Анализ частиц из меню Анализ. Установите порог минимального размера на уровне 10 000 мкм2 и круговость между 0,50 и 1,00. Выберите опцию Ellipses из меню Show drop-down. Проверьте Суммировать, Исключить по краям и in situ Показать и нажмите на кнопку OK. Обработайте все изображения стека. Визуально осматривайте соответствие эллипсов с сферами и, при необходимости, корректируйте количество частиц соответственно. Сумма рассчитывает от всех кадров каждой скважины, чтобы получить общее количество маммографий на скважину. 5. Совокупный расчет кривой роста ПРИМЕЧАНИЕ: Количество маммосфер, подсчитанных в каждой скважине в конце каждого прохода (PN),отражает количество маммосферных клеток, посеянных в начале PN. Для каждого прохода (PN),регистрируйте число накрытых клеток и количество клеток и сфер подсчитанных в наилучшим образом. Рассчитайте размер сферы в конце каждого отрывка:размер сферы PN (клетки / сфера) – клетки, подсчитанные PN / сферы, подсчитанные PNПРИМЕЧАНИЕ: Размер сферы в PN является мерой пролиферативного потенциала каждой маммосферы-инициирующей клетки, посеянной при PN. Вывод число покрытых сфер путем деления числа ячеек, покрытых для PN, по размеру сферы, рассчитанному в конце предыдущего прохода (PN-1):сферы, покрытые PN и клетками, покрытыми PN / размером сферы PN-1ПРИМЕЧАНИЕ: По конвенции, размер сферы предполагается стабильным во время первого прохождения культуры (т.е. размер сферы P0 и размер сферы P1). Если несколько скважин используются в качестве технических репликаток, используйте средний размер сферы в PN-1 в качестве знаменателя. Рассчитайте кумулятивное число клеток и сферы для каждой скважины за проход:кумулятивный номер PN (граф PN / покрывало PN) X кумулятивное число PN-1.ПРИМЕЧАНИЕ: По конвенции, кумулятивный номер P0 и покрывало P1. Если несколько скважин используются в качестве технических репликаций, вычислите среднее совокупное число на образец или условие для каждого прохода. Участок точки данных по полу-логарифмической шкале. Отображение номера прохода (P0 до PN)на оси x (линейная шкала) и кумулятивного числа ячейки или сферы на оси y (логарифмическая шкала). Fit экспоненциальной линии тренда к точкам данных и вычислить коэффициент определения (R2) для измерения доброты подходят.ПРИМЕЧАНИЕ: Линия тренда, приспомещаемые к точкам данных, должна приблизиться к экспоненциальной кривой, как ожидается, для популяции клеток, которая растет или умирает с постоянной скоростью. R2 принимает значения между 0 и 1, с значениями ближе к 1, что указывает на лучшую посадку. Изобразите уравнение трендовой линии как естественную экспоненциальную функцию, чтобы сделать вывод о темпах роста (GR) культуры:y yy 0 e(GR)x, где y0 является значением y, когда х 0.

Representative Results

Myc переэкспрессии в нормальных MECs, приводит к увеличению частоты маммосферы инициирующих клеток. Это достигается с помощью двойного механизма: Myc увеличивает скорость симметричных делений MaSC и частоту перепрограммирования прародителей в новые MaSCs11. Чтобы проверить влияние низкой составной экспрессии Myc, мы использовали трансгенную модель мыши Rosa26-MycER, в которой активность Myc может быть индуцирована 4-гидрокситамоксифеном (4-OHT)15. Сначала мы покрывали MECs ультра-низкой адгезией 6-коловидных пластин для удаления фибробластов, в отсутствие 4-OHT. После первого прохода мы разделили культуру на две части: две скважины остались необработанными (контрольные) и две скважины обработали 200 нм 4-OHT (MycER). Мы насчитали сферу и число клеток 5 последовательных проходов для трех независимых экспериментов(таблица 1). Совокупные числа клеток и сфер на проходе отображаются на таблице 2. Индукция с 4-OHT приводит к увеличению сферы и темпов роста клеток, как показано на рисунке 1. Рисунок 1: Результаты представительных представлений. Совокупная сфера(A)и клеточные(B)кривые роста контроля и mammospheres MycER. Показано среднее и стандартное отклонение от 3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 1-е покрытие 2-е покрытие 3-е покрытие 4-е покрытие Пятый покрытие Клетки покрыли Сотовый граф Сфера граф Клетки покрыли Сотовый граф Сфера граф Клетки покрыли Сотовый граф Сфера граф Клетки покрыли Сотовый граф Сфера граф Клетки покрыли Сотовый граф Сфера граф Exp1 Управления 77,000 50,000 31 65,000 58,500 41 57,000 30,000 32 30,000 22,000 5 22,000 0 0 77,000 81,000 41 65,000 55,000 23 Микер 77,000 31,0000 193 80,000 375,000 323 80,000 380,000 217 80,000 220,000 223 80,000 170,000 155 77,000 110,000 142 80,000 505,000 396 80,000 270,000 149 80,000 290,000 194 80,000 250,000 160 Exp2 Управления 75,000 75,000 71 60,000 17,000 34 28,000 45,000 29 45,000 13,000 2 13,000 0 0 75,000 47,000 45 60,000 11,000 47 Микер 75,000 200,000 188 80,000 225,000 277 80,000 230,000 155 80,000 210,000 211 80,000 100,000 95 75,000 250,000 192 80,000 202,500 283 80,000 305,000 185 80,000 160,000 237 80,000 100,000 133 Exp3 Управления 82,500 130,000 121 80,000 45,000 105 80,000 110,000 86 80,000 58,500 75 58,500 58,500 78 82,500 125,000 177 80,000 71,250 42 Микер 82,500 325,000 457 80,000 610,000 327 80,000 367,000 309 80,000 500,000 260 80,000 115,000 146 82,500 475,000 463 80,000 455,000 392 80,000 415,000 204 80,000 470,000 295 80,000 185,000 161 Таблица 1: Количество сфер подсчитано и числа ячеек, покрываемых и подсчитанных в каждом отрывке. Таблица 2: Расчет покрытых сфер и кумулятивной сферы и числа клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой таблицы. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Discussion

Здесь мы описываем протокол для количественного описания свойств роста MaSC in vitro. В качестве примера мы представляем эффект низкоуровневого составного выражения Myc на нормальные моринские маски. Однако этот подход может в равной степени применяться к различным контекстам. Первичные клетки человека или мурина, а также установленные клеточные линии могут быть культивированы в якорных независимых условиях для создания маммосферных культур, которые могут быть последовательно проложены. Переэкспрессия гена и РНК-интерференции могут быть легко введены в протокол с добавлением шага вирусного трансдукции в конце первого прохода (после шага 3.5). Кроме того, клетки могут быть инфицированы в сливе, а затем покрыны как маммосферы.

Критическим аспектом исследования, представленного здесь, является плотность посевных клеток, которая должна быть достаточно низкой, чтобы избежать генерации агрегатов, мешающих интерпретации результатов16,17. Морфология маммосфер может быть информативным, чтобы решить эту двусмысленность. Только компактные, круглые сферы должны быть перечислены в конце каждого прохода. Следует учитывать как круговость сфероидов, так и размер. Используя автоматизированный процесс DIA, этот шаг обеспечивается с соответствующими пороговыми значениями в объективной и абсолютной манере. Часто, прародители образуют ацинар структур или меньших кластеров клеток, которые должны быть исключены из маммосферы рассчитывает. Как правило, мы используем порог диаметром 100 мкм. Наконец, следует позаботиться о том, чтобы избежать переноса нетронутых или неполно диссоциированных маммопшеров из одного прохода в другой. С другой стороны, избыток пипетки приведет к увеличению смертности клеток. Таким образом, если такие трудности возникают, мы рекомендуем использовать мягкую трипсинизацию или лечение аккутазой и прохождение разъединенных сфер через 40 мкм ситечко для обеспечения генерации одноклеточных спойок.

Эффективность формирования сферы (SFE) была использована альтернативно, в качестве суррогата для SC или CSC количественной оценки ex vivo в маммосферных культурах. SFE действительно мера стволовых, как клетки в данной популяции клеток. Однако он представляет собой менее добросовестный подход, поскольку он предоставляет информацию только в определенные моменты времени. Расчет кумулятивных чисел сферы и генерации кумулятивных кривых роста, напротив, позволяет сделать вывод о темпах роста культуры с начального шага посева клеток до тех пор, пока культура не выхлопнет или, в случае увековеченных культур, желаемое количество проходов. Оценка свойств роста позволяет оценить отклонение от экспоненциального роста через коэффициент R2 и, на втором этапе, оценку самой стоимости ГР.

Важно отметить, что кумулятивные кривые роста маммографии могут быть использованы для оценки влияния малых ингибиторов молекулы или других химиотерапевтических препаратов избирательно на уровне CSC6,11. В отличие от обычных первичных маммосфер, которые функционально выхлопываются в 5-7 проходах, опухолевые маммосферы, как правило, расширяются бесконечно. Эта функция связана с неограниченной способностью самообновления CSC. Влияние на пролиферацию и самообновление CSC может быть разъединено через генерацию опухолевых клеток и маммосферных кривых роста, соответственно. CSC-специфический эффект, как ожидается, приведет к снижению совокупного роста маммосферы, с или без влияния на совокупный темп роста клеток6,11.

Наконец, еще одна область интереса является одним из взрослых тканей SC перепрограммирования. Полностью выращенные маммосферы состоят из фенотипически неоднородной популяции клеток, в которой лишь незначительная часть сохраняет стволовые, как особенности, в том числе маммосфера-испирации способности и маммарийской железы регенерации при трансплантации в vivo6,9,11,18,19. Маммарийские прародители могут быть, таким образом, изолированы либо с помощью in vitro этикетки удерживающих анализы6,9,11 или, ex vivo, используя установленные поверхностные маркеры2,3. Примечательно, что молочные прародители не выживают ануики и не могут образовывать маммосферы. Принудительное выражение Myc было показано, чтобы предоставить маммосферу инициации потенциал для молочной прародителей изолированы как PKHneg11, в результате чего поколение культуры, которые могут быть переданы на неопределенный срок. Аналогичным образом, вмешательство отрицательных регуляторов физиологического перепрограммирования может быть проверено с помощью того же асссе. В этом контексте общей проблемой, которая может возникнуть, является ограниченное количество входных ячеек. Если ввод клеток ниже 10 000 клеток, мы рекомендуем посев в 24-ну колодцах (максимум 5000 жизнеспособных клеток/мл). Тем не менее, условия независимой культуры крепления могут быть слишком суровыми для перепрограммирования, особенно в тех случаях, когда эффект перепрограммирования не является непосредственным. В таких случаях использование благоприятной матрицы и трехмерных органоидных культур может быть более подходящим20.

В целом, маммосферный асссеявляется является экономически эффективным вариантом, который может быть легко использован для скоринга стволовых свойств в нормальных и опухолевых MEC населения. Количественный подход, принятый в этом протоколе, облегчает сопоставление культур, проводимых в различных условиях или подверженных различным стимулам. При строгом следовании, он обеспечивает относительно простую систему модели ex vivo, которая позволяет разъединять несколько игроков, которые определяют свойства стволовых в vivo, предлагая возможность более детальных механистических исследований.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Бруно Амати за добрый подарок трансгенной модели мыши Rosa26-MycER. Эта работа финансировалась за счет грантов WWCR, AIRC, ERC и Итальянского министерства здравоохранения P.G.P. T.V. и X.A. при поддержке FIRC и A.S. грантом FUV.

Materials

ACK lysis buffer Lonza 10-548E Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL.
B27 Invitrogen 17504-044 B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v.
bFGF Peprotech 100-18B Human recombinant fibroblast growth factor – basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v.
Collagenase Sigma C2674 Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v.
DMEM Lonza 12-614F Dulbecco's modified Eagle's medium
DPBS Microgem S17859L0615 Dulbecco's phosphate buffered saline
EGF Tebu-Bio AF-100-15 Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v.
Glutamine Lonza 17-605E L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v.
Heparin PharmaTex 34692032 Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v.
Hyaluronidase Sigma H4272 Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v.
Hydrocortisone Sigma H0888 Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v.
Insulin SAFCBiosciences 91077C Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v.
Low attachment 6-well plates Corning 351146 Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid.
MEBM Lonza CC-3151 Mammary epithelial cell growth basal medium
Penicllin-Streptomycin mixture Lonza 17-602F Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v.
Poly-HEMA Sigma P3932 Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  2. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  3. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  4. van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland. Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).
  5. Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).
  6. Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).
  7. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  8. Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).
  9. Pece, S., et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140 (1), 62-73 (2010).
  10. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  11. Santoro, A., et al. p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value. Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).
  12. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  13. Gao, H., et al. Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters?. Springerplus. 5, 140 (2016).
  14. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  15. Murphy, D. J., et al. Distinct thresholds govern Myc’s biological output in vivo. Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).
  16. Bailey, P. C., et al. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 8, 29-39 (2018).
  17. Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  18. Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment. PLoS One. 6 (11), (2011).
  19. Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
  20. Panciera, T., et al. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).

Tags

Mammosphere CultureSelf-renewalBreast Stem CellsQuantificationCell CultureCell IsolationCell CountingCell LysisUltra-low AdhesionPrimary Mammosphere Formation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Vlachou, T., Aobuli, X., D’Elia, E., Santoro, A., Moroni, M. C., Pelicci, P. G. Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures. J. Vis. Exp. (153), e60256, doi:10.3791/60256 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image