マウスマンモスフィア培養における自己再生の定量

インビボ手続きは、EU指令2010/63に従い、当社の機関倫理委員会(動物ウェルベシングのための生物–OPBA)およびイタリア保健省(IACUC番号762/2015および537/2017)の承認を受けた後に行われました。 1. マウス乳腺採取と消化 典型的な実験では、CO2吸入により8-10週齢の処女雌マウスを犠牲にする。実験の目的に応じて、5〜30匹のマウスを使用してください。フードの下の解剖板にマウスを置きます。針を使って前肢を伸ばし、エタノールで動物の毛皮を洗い流します。 鉗子で皮膚を持ち上げ、骨盤領域のレベルから始まり、子宮頸部まで移動して腹腹をそのままにして垂直切開を行う。皮膚や腹腹が破裂しないようにするには、丸いはさみを使用します。 体の横軸を横切るはさみのやさげで、肌を慎重に取り外します。 皮膚が胸部および腹部から完全に剥離したら、動物の4つの手足を横切って4つの切開を行い、針で皮膚を固定する。はさみと鉗子を使用して、拡張された皮膚から動物の体を完全に取り外します。 鉗子を使用して、完全に露出している乳腺脂肪パッドを穏やかに持ち上げ、はさみの助けを借りて慎重に皮膚から取り外します。各マウスの下部胸部および腹部乳腺を収集し、50 mL円錐形チューブでダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に浸漬します。チューブあたり最大20の腺を収集します。ティッシュを氷の上に置いておきなさい。注:必要に応じて、腺は一晩氷の上にとどまることができます。ここは安全な停止点です。以下のステップは、滅菌条件下で行う必要があります。 消化媒体を調製し、フィルタリングする:ダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)2mMグルタミン、100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、200 U/mLコラゲターエーゼおよび100μg/mLヒアルロニダーゼ(材料表参照)を添加した。 最大20gを100mmのペトリ皿に移し、メスまたは湾曲したはさみを使用して組織をミンチします。大量のDPBSを皿に移さないでください。 各ペトリ皿に10mLの消化媒体を加え、25 mLの血清学的ピペットを使用して、50 mL円錐形チューブに細分化された組織を移します。 パラフィルムでチューブを密封し、ローテーターの上に置きます。ローテータを低速(0.03 x g)に設定し、5%CO2を含む湿気の多い雰囲気の中で37°Cで2.5時間インキュベートします。 次の手順に進む前に、サスペンションを目視で検査します。大きな組織が未消化のままである場合は、さらに30分間37°Cでインキュベーションを延長する。注:代替として、消化は、37°、5%CO2、穏やかなコラゲターゼ/ヒアルロニダーゼ酵素ミックス13を用いて一晩行うことができる。 2. 一次マウスMECの分離 ローテーターを停止し、インキュベーターからチューブを取り外します。5 mL の血清学的ピペットの開口部で P1000 チップを調整します。サスペンションがP1000チップを通過する場合は、次の手順に進みます。それ以外の場合は、さらに30分間37°Cでインキュベーションを延長する。 遠心分離機は100 x g、4°Cで5分間。慎重に上清をデカントし、DPBSの3 mLで各チューブのペレットを再中断します。注:低い遠心分離速度はリンパ球および脂肪組織細胞の除去を可能にする。このステップでペレットを離れないように、穏やかな操作が必要です。 100、70および40μmの細胞ストレーナーを使用して、各チューブ内の細胞懸濁液を別々に濾過する。各フィルタリングステップで、パススルーを収集する前に、2 mLのDPBSでストレーナーを洗浄します。注:この時点から、セル懸濁液をプールして一緒に処理できます。 遠心分離機は300 x g、4°Cで5分間。慎重に上清をデカントし、DPBSの残りのボリューム内の細胞を再中断します。 塩化アンモニウムカリウム(ACK)リシス緩衝液の等量を加えて赤血球(RBC)リシスに進む(材料表を参照)。ピペットで混ぜ、氷の上で最大5分間インキュベートします。 DPBSと遠心分離機を300xgで10mL加え、4°Cで5分間加えます。慎重に上清をデカントし、目視でペレットを検査します。ペレットが白い場合は、次のステップに進みます。それ以外の場合は、RBCリシスステップを繰り返します(ステップ2.5)。 マンモスフィア培地の1-5 mLで細胞ペレットを再中断する:乳腺上皮細胞増殖基底培地(MEBM)、2mMグルタミンを添加し、 100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、5 μg/mL インスリン、0.5 μg/mL ヒドロコルチゾン、2% B27、20 ng/mL 表皮成長因子 (EGF)、20 ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)および 0.4 IU/mL 3. シリアルマンモスフィア再めっき マンモスフィア培養物の確立のために、細胞を処理した非組織培養(超低接着)6ウェルプレート上に、マンモスフィア培地中の200,000個の生存細胞/mLの密度でプレートをプレート化します。細胞を37°Cで7〜10日間インキュベートし、5%CO2. 95%エタノールで1%ポリHEMA溶液を調製し、濾過する(材料表を参照)。以下の通路用の超低接着6ウェルプレートをコートし、ウェル当たり1%ポリHEMA溶液の400μLを添加し、エタノールを完全に乾燥させる。より良い結果を得るには、コーティングを2回繰り返します。注:最初の通路の間に非コーティングされた版の使用は培養からの線維芽細胞の選択的な除去を可能にする。 7-10日間の培養の終わりに、すべての井戸から一次マンモスフィアを収集し、300 x gで遠心分離機を、4°Cで5分間収集します。 慎重に上清をデカントし、フィルタリングされた先端を持つP200ピペットを使用してマンモスフィアの機械的解離に進みます。ピペットを約100回、大きなスフェロイドの有無を目視で検査します。注:37°C、5%CO2でトリプシンまたはアキュターゼの少量(0.2-0.5 mL)の球ペレットの短いインキュベーション(2-5分)を使用して、機械的解離を容易にすることができます。各通路のめっき用に新鮮なマンモスフィア培地(ステップ2.7)を準備します。 新鮮なマンモスフィア培地の1〜5 mLで再サスペンドし、生存細胞を数えます。該当する場合は、細胞を治療群または培養条件で分割する。 プレート20,000の生細胞/mL上のポリHEMAコーティングされた超低接着6ウェルプレートと37°でインキュベートし、5%CO2。注:マンモスフィアは、細胞めっき後5〜7日以内に最大サイズに達する。可能であれば、各サンプルまたは条件の細胞を複数のウェルに分配し、技術的な複製を得る。細胞凝集を避けるために、めっき密度を低く保つ必要があります。6ウェルプレートには最大20,000セル/mL、24ウェルプレートには5,000セル/mLを推奨します。 5~7日後、井戸あたりの球数を数えます。これは、10倍の倍率レンズを搭載した顕微鏡を使用するか、デジタル画像解析を使用して手動で行うことができます(ステップ4を参照)。 各井戸のマンモスフィアを別々に収集し、300 x gで遠心分離機を4°Cで5分間収集します。 慎重に上清をデカントし、フィルタリングされた先端を持つP200ピペットを使用してマンモスフィアの機械的解離に進みます。ピペットを約100回、大きなスフェロイドの有無を目視で検査します。 新鮮なマンモスフィア培地の1 mLで再サスペンドし、生存細胞を数えます。各サンプルまたは条件のセルをプールし、手順 3.6~ 3.10 を繰り返します。めっきされた細胞の数と、各通路のウェルごとにカウントされる球体と細胞の数を記録します。累積成長計算のステップ 5 に進みます。 4. デジタル画像解析(DIA)を用いた球体列挙 各通路の終わりに、すべての井戸の表面全体をスキャンし、ステレオスコープに取り付けられたデジタルカメラを使用して球体の画像を取得します。イメージを .tif ファイルとして保存します。 ImageJ14を使用して、ステレオスコープイメージをイメージシーケンスとして読み込む 。画像の縮尺と種類を 8 ビットに設定します。 イメージのスタックを複製し、メニューバーの「プロセス」タブから「背景を減算」を選択します。オプションライトの背景とスライド放物面をチェックし、ボタンOKをクリックします。スタックのすべてのイメージを処理します。 メニュー バーの [イメージ]タブから [調整]を選択し、[しきい値]を選択します。[適用]をクリックすると、[スタックをバイナリに変換]というタイトルのダイアログ ウィンドウが表示されます。[方法として既定]を選択し、[背景としてライト]を選択します。[各イメージのしきい値を計算する] チェックボックスをオンにし、[OK]ボタンをクリックします。 メニューバーのタブの下にある「バイナリ」リストから「流域」、「開く」、「侵食」のコマンドを順番に選択します。表示されるダイアログ ボックスの [はい]ボタンをクリックして、スタックのすべてのイメージを処理します。注:これらのプロセスにより、オブジェクトのエッジからピクセルをタッチ、オブジェクトスムージング、および削除するオブジェクトを視覚的に分割できます。 [分析]メニューから[パーティクルを分析]機能を選択します。最小サイズしきい値を 10,000 μm2に設定し、円形を 0.50 ~ 1.00 に設定します。[表示]ドロップダウン メニューからオプションの省略記号を選択します。[要約]をオンにし、[エッジに除外]、および[In situ Show]をオンにして、[OK]ボタンをクリックします。 スタックのすべてのイメージを処理します。 球との楕円の対応を視覚的に検査し、必要に応じてパーティクル数を修正します。各ウェルのすべてのフレームからのカウントを合計して、ウェルあたりのマンモスフィアの合計数を取得します。 5. 累積成長曲線計算 注:各通路の終わりに各ウェルでカウントされるマンモスフィアの数(PN)は、PNの始めに播種されたマンモスフィア開始細胞の数を反映する。 各通路(PN)について、めっき細胞の数と井戸ごとにカウントされる細胞と球の数を登録します。各通路の終点の球のサイズを計算します。球サイズPN(セル/球)=細胞カウントPN/球数PN注:PNにおける球体サイズは、PNに播種された各マンモスフィア開始細胞の増殖電位の尺度である。 PN用にめっきされたセルの数を前の通路の終端で計算された球のサイズで割ることによって、めっきされた球の数を推測する(PN-1):球板めっき PN = セルメッキ PN / 球サイズ PN-1注:慣例により、球のサイズは、培養の最初の通路(すなわち、球サイズP0=球サイズP1)の間に安定していると仮定される。複数のウェルがテクニカル複製として使用される場合は、分母としてPN-1の平均球サイズを使用します。 各ウェルの各ウェルの累積セルと球数を計算します。累積数 P= (カウント PN / めっき PN) X 累積数P-1.注:慣例により、累積数 P0 = めっき P1.複数の井戸が技術的な複製として使用される場合は、各通路のサンプルまたは条件あたりの平均累積数を計算します。 半対数スケールでデータ ポイントをプロットします。x 軸 (線形スケール) に通路番号 (P0 ~ PN)を表示し、y 軸に累積セルまたは球数 (対数スケール) を表示します。 指数トレンド線をデータポイントにフィットさせ、決定係数(R2)を計算して適合度を測定します。注:データ ポイントに適合する傾向線は、一定の割合で成長または死亡するセル集団に対して予想されるように、指数曲線を近似する必要があります。R2は 0 ~ 1 の値を取り、1 に最も近い値はより適切な適合を示します。 トレンドラインの方程式を、培養の成長率(GR)を推測する自然な指数関数として描写します。y = y0 e(GR)x、 y0はx = 0 の場合の y の値です。