Kwantificering van zelf vernieuwing in Muriene Mammosphere culturen
Summary
Hier beschrijven we de uitvoering en interpretatie van de resultaten van een in vitro mammosphere zelf vernieuwing kwantitatieve assay.
Abstract
De borstklier wordt gekenmerkt door uitgebreide regeneratiecapaciteit, omdat het door massale hormonale veranderingen doorheen de levenscyclus van een vrouwtje gaat. De rol van borst stamcellen (MASCS) wordt breed bestudeerd zowel in de fysiologische/ontwikkelings context en met betrekking tot borst carcinogenese. In dit aspect zijn ex vivo-studies gericht op de eigenschappen van MaSC zeer gewild. Mammosphere culturen vormen een surrogaat van orgaan vorming en zijn een waardevol hulpmiddel geworden voor zowel fundamenteel als translationeel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het opwekken van primaire mammosphere culturen en de kwantatie van de MaSC groei eigenschappen. Het protocol omvat de verzameling en spijsvertering van de borstklier, isolatie van primaire zoogdieren epitheelcellen (MECs), de oprichting van primaire mammosphere culturen, seriële passage, kwantatie van mammosphere groei parameters en interpretatie van de resultaten. Als voorbeeld presenteren we het effect van de constitutieve Myc-uitdrukking op een laag niveau op normale MECs die leiden tot meer zelf vernieuwing en proliferatie.
Introduction
Isolatie en in vitro cultuur van borstklier epitheel stam en voorlopercellen zijn essentieel geworden voor het begrijpen van hun eigenschappen in de borst Cell biologie. Elegante Lineage tracing en seriële transplantatie testen hebben de studie van stamcellen (SCs) en andere weefsel subgroepen in de context van hun in vivo niche mogelijk gemaakt. Deze aanpak is echter tijdrovend en vereist het genereren van Reporter Muismodellen1,2,3,4,5. Daarom is in vitro cultuur en voortplanting van borst cellen (MaSCs), terwijl het sparen van belangrijke stemness kenmerken, namelijk zelf vernieuwing en differentiatie vermogen, een van de grootste uitdagingen in het veld. In de afgelopen jaren is de mammosphere assay op grote schaal gebruikt om zowel normale borstweefsel-als borstkanker groei te modelleren, om normale of kanker SCs (CSCS) te kwantificeren en hun zelfvernieuwings vermogen te beoordelen als surrogaat reporter van hun activiteit in hun respectievelijke in vivo context6,7,8,9,10,11.
De mammosphere assay is een efficiënte en kosteneffectieve aanpak, waarbij vers geïsoleerde borst cellen (MECs) worden gekweekt in niet-aanhandige omstandigheden, met de veronderstelling dat alleen MaSCs zullen overleven en bollen in suspensie vormen, terwijl alle andere celtypen zullen sterven door anoikis. Bovendien is het vermogen om meerdere generaties mammosferen te vormen in seriële niet-aanhandige passages gerelateerd aan het zelfvernieuwings vermogen van de MASCS6,9,11. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol van een kwantitatieve mammosphere Assay, die oorspronkelijk werd ontwikkeld door dontu en collega’s7 als een wijziging van de baanbrekende neurosphere assay12, waardoor de groei van vermoedelijke SCs in niet-aanhangende, serum vrije omstandigheden met de toevoeging van passende groeifactoren7,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor de kwantitatieve beschrijving van de MaSC-groei-eigenschappen in vitro. Als voorbeeld presenteren we het effect van de constitutieve Myc-uitdrukking op een laag niveau op normale Murine-MaSCs. Deze benadering kan echter ook op verschillende contexten worden toegepast. Menselijke of murene primaire cellen, evenals gevestigde cellijnen, kunnen worden gekweekt in verankerings onafhankelijke voorwaarden om mammosphere culturen te vestigen die kunnen worden doorgangen. Gen-overexpressie en RNA-interferentie kunnen eenvoudig in het protocol worden geïntroduceerd met de toevoeging van een virale transductie stap aan het einde van de eerste passage (na stap 3,5). Als alternatief kunnen cellen worden geïnfecteerd in adhesie en vervolgens geplateerd als mammobollen.
Een kritisch aspect van de bepaling die hier wordt gepresenteerd, is de celdichtheid zaaien, die laag genoeg moet zijn om te voorkomen dat de opwekking van aggregaten de interpretatie van de resultaten16,17verstoort. De morfologie van de mammobollen kan informatief zijn om deze onduidelijkheid op te lossen. Alleen compacte, ronde bollen moeten worden geïnventariseerd aan het einde van elke passage. Zowel de circulariteit van de sferoïden als de grootte moet in aanmerking worden genomen. Met gebruikmaking van het geautomatiseerd proces van de DIA wordt deze stap op objectieve en absolute wijze verzekerd met de juiste drempels. Vaak, voor ouders zullen acinaire structuren of kleinere clusters van cellen die moeten worden uitgesloten van de mammosphere graven vormen. Als vuistregel gebruiken we een drempelwaarde van 100 μm diameter. Ten slotte moet worden gezorgd om te voorkomen dat de overdracht van ongeschonden of niet-volledig gescheiden mammopsherzen van de ene passage naar de volgende wordt vermeden. Aan de andere kant, overtollige Pipetteer zal leiden tot een verhoogde celdood. Dus, als dergelijke moeilijkheden worden ondervonden, raden we aan milde trypsinoisatie of accutase behandeling te gebruiken en de gezien bollen door een 40 μm zeef te passeren om de aanmaak van eencellige suspensies te garanderen.
Sphere forming efficiency (SFE) is als alternatief gebruikt, als surrogaat voor SC of CSC kwantatie ex vivo in mammosphere culturen. SFE is inderdaad een maat voor stam-achtige cellen in een bepaalde celpopulatie. Het vertegenwoordigt echter een minder gewetensvolle aanpak, aangezien het alleen op verschillende tijdstippen informatie verschaft. De berekening van de cumulatieve bol-getallen en het genereren van cumulatieve groeicurven, in plaats daarvan, maakt het mogelijk dat de groeisnelheid van de cultuur van de initiële cel zaaien stap tot de cultuur Uitlaten uitstoten of, in het geval van vereeuwigd culturen, voor het gewenste aantal passages. De beoordeling van de groei-eigenschappen maakt de evaluatie mogelijk van de afwijking van de exponentiële groei door de coëfficiënt R2 en, bij een tweede stap, de beoordeling van de GR-waarde zelf.
Belangrijk is dat cumulatieve mammosphere groeicurven kunnen worden gebruikt om het effect van kleine molecuul remmers of andere chemotherapeutische geneesmiddelen selectief te evalueren op de CSC-niveau6,11. In tegenstelling tot de normale primaire mammospheres, die functioneel uitlaat in 5-7 passages, hebben tumor mammospheres de neiging om oneindig uit te breiden. Deze functie is gekoppeld aan de onbeperkte CSC-mogelijkheid voor zelf verlenging. De effecten op proliferatie en CSC-zelf vernieuwing kunnen worden losgekoppeld door respectievelijk het genereren van tumorcellen en mammosphere groeicurves. Er wordt verwacht dat een CSC-specifiek effect resulteert in een afname van de cumulatieve mammosphere groeisnelheid, met of zonder effect op de cumulatieve celgroei snelheid6,11.
Tot slot, een ander gebied van belang is het een van Adult weefsel SC herprogrammering. Volgroeide mammosferen bestaan uit een fenotypisch heterogene celpopulatie, waarin slechts een kleine fractie stam achtige kenmerken behoudt, waaronder het initiëren van mammosphere en het starten van de borstklier bij transplantatie in vivo6,9,11,18,19. Mammary voorlopercellen kunnen dus worden geïsoleerd hetzij met behulp van in vitro label-behoud van de assays6,9,11 of, ex vivo, met behulp van gevestigde oppervlakte markeringen2,3. Met name, borst voor ouders overleven anoikis niet en zijn niet in staat om mammosferen te vormen. Afgedwongen Myc-uitdrukking is aangetoond dat het mammosphere initiatie potentieel verleent aan borst voorlopercellen die zijn geïsoleerd als pkhneg11, resulterend in de generatie van een cultuur die voor onbepaalde tijd kan worden doorgegeven. Evenzo kan interferentie van negatieve regulatoren van fysiologische herprogrammering worden getest met dezelfde test. In deze context is een veelvoorkomend probleem dat zich kan voordoen het beperkte aantal celinvoer. Als de celinvoer lager is dan 10.000 cellen, raden we aan te zaaien in 24-Well platen (maximaal 5.000 levensvatbare cellen/mL). Niettemin kan worden aangetoond dat de onafhankelijke cultuur voorwaarden van de verankering te streng zijn voor het scoren van herprogrammering, met name in gevallen waarin het herprogrammeeringeffect niet onmiddellijk is. In dergelijke gevallen zou het gebruik van een ondersteunende matrix en 3-dimensionale organoïde culturen geschikter kunnen zijn20.
Over het algemeen is de mammosphere assay een kosteneffectieve optie die gemakkelijk kan worden gebruikt voor het scoren van stam achtige eigenschappen in normale en tumorele MEC-populaties. De kwantitatieve benadering in dit protocol vergemakkelijkt de vergelijkingen tussen culturen die in verschillende omstandigheden worden uitgevoerd of aan uiteenlopende stimuli worden blootgesteld. Wanneer nauwgezet gevolgd, biedt het een relatief eenvoudig ex vivo modelsysteem dat het mogelijk maakt om de meerdere spelers die stam eigenschappen definiëren in vivo te ontkoppelen, en biedt de mogelijkheid van gedetailleerdere mechanistische studies.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Bruno Amati voor het vriendelijke cadeau van het Rosa26-MycER transgene muismodel. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van WWCR, AIRC, ERC en het Italiaanse ministerie van volksgezondheid aan P.G.P. T.V. en X.A. werden ondersteund door FIRC en A.S. door een FUV-subsidie.
Materials
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor – basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
| Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
| DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
| DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
| EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
| Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
| Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
| Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
| Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |
References
- Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland. Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).
- Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).
- Pece, S., et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140 (1), 62-73 (2010).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Santoro, A., et al. p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value. Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gao, H., et al. Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters?. Springerplus. 5, 140 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Murphy, D. J., et al. Distinct thresholds govern Myc’s biological output in vivo. Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).
- Bailey, P. C., et al. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 8, 29-39 (2018).
- Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Panciera, T., et al. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
