القياس الكمي للتجديد الذاتي في ثقافات Murine ماموسفيري
Summary
هنا ، ونحن وصف تنفيذ وتفسير نتائج الفحص الكمي في المختبر ماموسفيري الذاتي تجديد.
Abstract
وتتميز الغدة الثديية بقدره التجديد واسعه النطاق ، كما انه يمر من خلال التغيرات الهرمونية الهائلة طوال دوره حياه الأنثى. يتم دراسة دور الخلايا الجذعية الثديية (MaSCs) علي نطاق واسع في السياق الفسيولوجي/التنموي وفيما يتعلق بسرطان الثدي. في هذا الجانب ، الدراسات المجرية السابقة تركز علي خصائص MaSC مطلوبه للغاية بعد. وتمثل الثقافات الماموسفيريه بديلا لتشكيل الأعضاء وأصبحت أداه قيمه للبحوث الاساسيه والانتقالية علي حد سواء. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتوليد الثقافات ماموسفيري الاوليه murine وكميه من خصائص النمو MaSC. ويشمل البروتوكول جمع الغدد الثديية والهضم ، وعزل الخلايا الظهاريه الثديية الاوليه (MECs) ، وإنشاء الثقافات الماموسفيريه الاوليه ، والمرور التسلسلي ، وتحديد الكمية من معلمات النمو الماموسفيري وتفسير النتائج. وعلي سبيل المثال ، فاننا نقدم تاثير التعبير Myc التاسيسي المنخفض المستوي علي الmecs العادية مما يؤدي إلى زيادة التجديد الذاتي والانتشار.
Introduction
وأصبحت العزلة والثقافة في المختبر من الجذعية الظهاريه الثديية والخلايا سلف ضرورية لفهم خصائصها في علم الاحياء الخلية الثديية. وقد مكنت التتبع السلالة الانيقه والمقايسات زرع المسلسل دراسة الخلايا الجذعية (SCs) والفرعية الانسجه الأخرى في سياق الخاصة بهم في مكانه الجسم الحيوي. ومع ذلك ، فان هذا النهج يستغرق وقتا طويلا ويتطلب توليد نماذج الماوس مراسل1،2،3،4،5. ولذلك ، في المختبر الثقافة وانتشار الخلايا الجذعية الثديية (mascs) في حين تجنيب الميزات الرئيسية ستيمنس ، وهي التجديد الذاتي والقدرة علي التمايز ، هو واحد من أكبر التحديات في هذا المجال. في السنوات الاخيره ، وقد استخدمت علي نطاق واسع ماموسفيري مقايسة لنمذجة كل من الانسجه الثديية العادية ونمو سرطان الثدي ، لتحديد الكمية الطبيعية أو السرطان SCs (cscs) وتقييم قدرتها علي التجديد الذاتي كمراسل بديل لنشاطهم في كل منهم في سياق فيفو6،7،8،9،10،11.
الفحص الماموسفيري هو نهج فعال من حيث التكلفة ، حيث يتم استزراع الخلايا الظهاريه الثديية المعزولة حديثا (MECs) في ظروف غير ملتصقة ، مع فرضيه ان MaSCs فقط سوف البقاء علي قيد الحياة وتشكيل المجالات في التعليق في حين ان جميع أنواع الخلايا الأخرى سوف يموت من قبل anoikis. وعلاوة علي ذلك ، فان القدرة علي تشكيل عده أجيال من الماموسفيريس في الممرات المتسلسلة غير الملتصقة ترتبط بقدره التجديد الذاتي لل mascs6،9،11. هنا ، ونحن وصف بروتوكول مفصل من الفحص الكمي ماموسفيري ، الذي تم تطويره في البداية من قبل dontu والزملاء7 كتعديل للفحص العصبي الرائد12، مما يتيح نمو SCs المفترضة في غير ملتصقة ، والظروف خاليه من المصل مع أضافه عوامل النمو المناسبة7،12.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، ونحن وصف بروتوكول لوصف كمي لخصائص النمو MaSC في المختبر. علي سبيل المثال ، نقدم تاثير التعبير Myc التاسيسيه منخفضه المستوي علي MaSCs العادية murine. بيد ان هذا النهج يمكن تطبيقه بالتساوي علي سياقات مختلفه. ويمكن استزراع الخلايا الاساسيه البشرية أو الاوليه ، فضلا عن الخطوط الخلوية الثابتة ، في الظروف المستقلة لإرساء الثقافات الماموسفيريه التي يمكن المرور بها بشكل متسلسل. ويمكن إدخال التعبير الفوقي للجينات وتداخل الحمض الريبي النيبالي بسهوله في البروتوكول مع أضافه خطوه الانتقال الفيروسية في نهاية الممر الأول (بعد الخطوة 3.5). بدلا من ذلك ، يمكن ان تكون الخلايا المصابة في التصاق ثم مطلي كما ماموسفيريس.
جانب حرجه من الفحص يقدم هنا البذر خليه كثافة, اي سوفت كنت منخفضه بكفاية ان يتفادى الجيل المجاميع يتداخل مع التفسير من النتيجات16,17. ويمكن لمورفولوجية الماموسفيريس ان تكون مفيده لحل هذا الغموض. وينبغي حصر المجالات المدمجة والمستديرة في نهاية كل مقطع. وينبغي ان يؤخذ في الاعتبار كل من دوران الخزان والحجم. باستخدام العملية المؤتمتة لل DIA ، يتم ضمان هذه الخطوة مع العتبات المناسبة بطريقه موضوعيه ومطلقه. في كثير من الأحيان ، فان الأسلاف تشكيل الهياكل اكينار أو مجموعات أصغر من الخلايا التي ينبغي استبعادها من التهم ماموسفيري. كقاعده عامه ، ونحن نستخدم عتبه 100 ميكرومتر قطرها. وأخيرا ، ينبغي توخي الحذر لتجنب نقل الماموبشيريس السليمة أو غير المنفصلة تماما من ممر إلى آخر. من ناحية أخرى ، سيؤدي الإفراط في الأنابيب إلى زيادة موت الخلايا. وهكذا ، إذا واجهت مثل هذه الصعوبات ، ونحن نوصي باستخدام التريسينزيشن خفيفه أو العلاج Accutase وتمرير المجالات المنفصلة من خلال مصفاه 40 μm لضمان توليد المعلقات أحاديه الخلية.
وقد استخدمت كفاءه تشكيل المجال (SFE) بدلا من ذلك ، كبديل لل SC أو CSC كميه الجسم السابق في الثقافات الماموسفيريه. SFE هو في الواقع مقياس للخلايا مثل الجذعية في السكان خليه معينه. ومع ذلك ، فانه يمثل نهجا اقل ضميري لأنه لا يقدم المعلومات الا في نقاط زمنيه متميزة. حساب أرقام المجال التراكمي وتوليد منحنيات النمو التراكمي ، بدلا من ذلك ، يمكن الاستدلال علي معدل نمو الثقافة من الخطوة الاوليه البذر الخلية حتى عوادم الثقافة أو ، في حاله الثقافات الخلد ، للعدد المطلوب من الممرات. ويسمح تقييم خصائص النمو بتقييم الانحراف عن النمو المتسارع من خلال المعامل R2 ، وفي الخطوة الثانية ، تقييم القيمة الوراثية نفسها.
الأهم من ذلك ، يمكن استخدام منحنيات النمو ماموسفيري التراكمي لتقييم تاثير مثبطات جزيء صغير أو ادويه العلاج الكيميائي الأخرى بشكل انتقائي في CSC المستوي6،11. خلافا لماموسفيريس الابتدائية العادية ، والتي العادم وظيفيا في 5-7 الممرات ، ماموسفيريس الورم تميل إلى توسيع إلى أجل غير مسمي. وترتبط هذه الميزة إلى غير محدود CSC القدرة علي التجديد الذاتي. الآثار علي الانتشار والتجديد CSC الذاتي يمكن ان تكون غير مقترنة من خلال توليد الخلايا السرطانية ومنحنيات النمو ماموسفيري ، علي التوالي. ومن المتوقع ان يؤدي التاثير الخاص بالديوان إلى انخفاض معدل النمو ماموسفيري التراكمي ، مع أو بدون تاثير علي معدل نمو الخلية التراكمي6،11.
وأخيرا ، مجال آخر من الاهتمام هو واحد من الكبار SC الانسجه أعاده برمجه. وتتكون ماموسفيريس المزروعة بالبالكامل من الخلايا غير المتجانسة من حيث الشكل الظاهري ، والتي يحتفظ فيها جزء صغير فقط بالسمات الشبيهة بالجذعية ، بما في ذلك القدرة علي البدء في الماموسفيري وتجديد الغدد الثديية عند الزرع في الجسم الفيفو6و9و11و18و19 التالي يمكن عزل الثديين الثديية اما باستخدام في المختبر الاحتفاظ بالعلامات الاختبارات6،9،11 أو ، السابق فيفو ، وذلك باستخدام علامات السطح الراسخة2،3. علي وجه الخصوص ، الأسلاف الثديية لا البقاء anoikis وغير قادرين علي تشكيل ماموسفيريس. وقد تبين القسري Myc التعبير لمنح ماموسفيري استهلال المحتملة لأسلاف الثدي معزولة كما PKHneg11، مما ادي إلى توليد ثقافة التي يمكن المرور إلى أجل غير مسمي. المثل ، يمكن اختبار تدخل المنظمين السلبيين لأعاده برمجه الفسيولوجية باستخدام نفس الفحص. وفي هذا السياق ، هناك مساله مشتركه قد تنشا وهي العدد المحدود من مدخلات الخلايا. إذا كان إدخال الخلية اقل من 10,000 الخلايا ، ونحن نوصي البذر في لوحات 24-حسنا (الحد الأقصى 5,000 خلايا قابله للحياة/مل). ومع ذلك ، يمكن إثبات الظروف الثقافية المستقلة انكوراج ان تكون قاسيه جدا لتسجيل أعاده برمجه ، وخاصه في الحالات التي يكون فيها تاثير أعاده برمجه ليست فورية. وفي مثل هذه الحالات ، يمكن ان يكون استخدام مصفوفة داعمه وثقافات organoid ثلاثية الابعاد أكثر ملاءمة ل20.
وعموما ، فان الفحص الماموسفيري هو خيار فعال من حيث التكلفة والذي يمكن استخدامه بسهوله لتسجيل الخصائص الشبيهة بالجذع في السكان العاديين والذين يعملون في الفم. وييسر النهج الكمي المتبع في هذا البروتوكول المقارنات بين الثقافات التي تجري في ظروف مختلفه أو التي تتعرض لمحفزات متنوعة. عندما يتبع بصرامة ، فانه يوفر نظام نموذجي السابقين الجسم الآخر بسيطه نسبيا التي تسمح بفك الاقتران من اللاعبين المتعددين التي تحدد خصائص الجذعية في الجسم المجري ، وتقدم امكانيه الدراسات الميكانيكية أكثر تفصيلا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر برونو Amati لهديه النوع من نموذج الماوس Rosa26-MycER المحورة وراثيا. تم تمويل هذا العمل من قبل المنح من WWCR ، AIRC ، والمنسق الخاص ، ووزارة الصحة الايطاليه إلى P.G.P. T.V. و X.A. كانت مدعومة من قبل FIRC والشركة الخاصة من قبل منحه FUV.
Materials
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor – basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
| Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
| DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
| DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
| EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
| Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
| Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
| Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
| Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |
References
- Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland. Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).
- Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).
- Pece, S., et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140 (1), 62-73 (2010).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Santoro, A., et al. p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value. Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gao, H., et al. Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters?. Springerplus. 5, 140 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Murphy, D. J., et al. Distinct thresholds govern Myc’s biological output in vivo. Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).
- Bailey, P. C., et al. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 8, 29-39 (2018).
- Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Panciera, T., et al. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
