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Biology

민물 홍합의 생식 상태 및 애벌레 개발을 특성화하기위한 비 치명적인 방법 표준화 (비발비아 : 유니온니다)

Published: October 04, 2019
doi:
10.3791/60244
, ,
1Wetland and Aquatic Research Center,United States Geological Survey, 2Garcon Point Aquatic Research Center,Florida Fish and Wildlife Conservation Commission

Summary

민물 홍합 보존은 종의 생식 패턴과 과정을 모니터링하는 데 달려 있습니다. 이 연구는 아가미 내용물 샘플링, 애벌레 개발 특성화 및 수집된 데이터에 대한 디지털 저장소제공을 위한 비치명적인 프로토콜을 표준화합니다. 이 프로토콜 데이터베이스 패키지는 홍합 연구원이 임페실 종의 회복에 중요한 도구가 될 것입니다.

Abstract

멸종 위기 종의 타이밍, 개발 및 생식 패턴을 적극적으로 모니터링하는 것은 인구 회복을 관리 할 때 중요합니다. 민물 홍합은 세계에서 가장 치명적인 생물 중 하나이지만 초기 애벌레 (glochidial) 개발 및 우울한 기간에 대한 정보는 여전히 많은 종에 부족합니다. 이전 연구는 여성 홍합이 숙주 물고기를 기생 할 준비가될 때 복잡한 삶의 역사 단계에 초점을 맞추고있다, 그러나 몇 연구는 우울한 기간과 애벌레 개발의 타이밍에 초점을 맞추고있다. 여기에 설명된 프로토콜을 통해 연구자들은 여성 홍합에 대한 중력 상태를 비-lethally 평가할 수 있습니다. 이 연구의 결과는 이 방법이 샘플링이 수행된 후에 중력을 유지하거나 다시 중력자가 되는 여성 홍합의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다. 이 방법의 장점은 연방 위협 또는 멸종 위기에 처한 종 또는 높은 보존 우려의 다른 인구에 그것의 사용을 허용 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 보존 된 또는 살아있는 개인 모두에 사용하기 위해 적응 될 수 있으며 다양한 홍합 종에서 테스트되었습니다. 제공된 데이터베이스는 생식 습관의 타이밍에 대한 광범위한 정보를 위한 저장소이며 향후 담수 홍합 연구, 보존 및 복구 노력을 촉진할 것입니다.

Introduction

담수 시스템에서 인구의 지속성은 재생산과 모집의 성공에 달려 있습니다. 기생 생물의 경우, 라이프 사이클의 복잡성을 식별 (예를 들어, 애벌레 개발 및 호스트 매력 전략의 단계) 유기체의 생식 습관과 모집에 영향을 미치는 중요한 프로세스에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이러한 정보는 종에 의해 방해될 때 중요해지고, 남아 있는 인구를 유지하기 위해 성공적인 모집이 필요하거나, 회복이 소멸된 인구를 재건하기 위해 포로 전파를 사용해야 하는 경우.

민물 홍합 (Bivalvia: Unionida)은 전 세계적으로 가장 난해한 생물 군 중 하나로 간주되며 종별 생식 습관을 편집하면 연구 노력에 도움이 될 수 있습니다1,2,3 ,4,5. 현재 전 세계에 분포된 800종 이상의 홍합은 북미와 남미, 동남아시아에서 다양성의 핫스팟을 가지고 있지만, 필수 생명역사 정보는 많은종2, 5,6,7. 이 순서 내의 가족은 호스트7,8에부착하는 동안 자유로운 생활 청소년으로 변신을 완료하는 기생 애벌레 단계를 갖는 것이 특징입니다. 이 독특한 삶의 역사 단계는 현재 위기에있는 담수 시스템의 생물 다양성에기여9. 높은 수준의 임페로는 수로의 오염, 서식지 변경 및 파괴, 숙주 물고기의 풍부함과 다양성감소, 침략적인 종의 도입 을 포함하여 많은 인위적위협에 기인할 수 있습니다1, 10. 벤틱 필터 피더로서 홍합은 기판으로 잠복하고유역(11)으로배출되는 오염물질 및 오염물질에 취약하다. 홍합 종의 회수는 탄소 격리, 식품 공급원, 필터공급에의한 수질 정화 등 다양한 생태계 서비스를 제공하기 때문에 관련이 있다. 또한 홍합은 생태계 의 건강을 나타내고, 생물 다양성을 촉진하며, 차례로 생태계12의탄력성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.

많은 담수 홍합 연구는 종 상태 평가 및 관리 전략을 더 잘 알리기 위해 초기 생명 역사 요구 사항을 조사하는 데 중점을 두었습니다. 본 연구와 관련된 민물 홍합 가족(예: 하이리대, 마가리페리대, 유니언디대)은 암컷이 화성 아가미8에서유충(glochidia)을 무리를 지어 사는 독특한 생명역사 전략을 가지고 있다. 다양한 전략을 통해, 여성 홍합은 마수피 아가미에서 성숙한 글로치디아를 추방하여 글로치디아13으로척추 동물 숙주들을 기생시한다. 아가미 내 의 글로시얼 개발에 대한 연구는 피하 주사기를 활용한 기술로부터 살아있는 홍합에서 생식샘체를 샘플링하고 게임테 생산14,15,16을평가하는 기술로부터 수정하였다. 연구진은 고나드 샘플링에 대한 이 비치명적인 방법론을 검증함에 따라, 무리 개발15,16을평가하기 위해 marsupial gill 샘플링에 적용되었다. 무리 개발은 일부 홍합 종은 외부 두 아가미 (ectobranchus), 단지 내부 두 아가미 (endobranchus) 또는 네 아가미 (테트라 브랜쿠스)에서 만 glochidia을 무리 수로 계통 유전학 관계를 해독하는 데 사용할 수 있지만,이 특성은 하지 않습니다 모든 종 에 대한 알려진17. 우울한 패턴은 이전에 암컷 홍합이 겨울(bradytictic) 또는 여름에 짧은 기간 동안 (tachytictic)18에의해 홍합 종을 분류하는 데 사용되어 왔다. 아노돈타의 생식 주기를 연구 할 때 홍합 무리의 겨울 동안 지원되었다19. 그러나, 기본적인 생식 생물학은 수년에 걸쳐 더 철저하게 공부되고 이 이분법은 몇몇 종의 총 일반화 및 우울한 기간이 원래 추정된20,21보다는 훨씬 더 복잡하다는 것을 것을을 발견했습니다. 예를 들어, 하이리델라(가족 하이리이대), 글레불라 및 엘리피오(패밀리 유니온이대)의 종은 번식기22,23,사육시기당 3마리 이상의 무리로 관찰되었다. 24. 종에 따라 복잡하고 때로는 인구별20,생식 습관의 복잡성으로 인해 우울의 시기와 기간에 대한 지식의 격차가 발생했으며 여성 홍합이 생성 할 수있는 무리의 수가 있습니다.

피하 주사기가 아가미 함량을 추출하는 데 사용되었지만 모든 연구에서 비교 가능한 결과를 보장하기 위해 표준화가 부족하여 결과를 보고하는 것은 복잡합니다. 이전에는 글로치디아의 4단계(즉, 난자, 배아, 미성숙, 완전 발달)가 유니온아이대에서 확인되었으나 표준 절차16,25,26으로채택되지 않았다. 마가리테리대의 구성원을 관찰하는 다른 연구는 ‘미성숙 글로시디아’의 분류를 ‘개발 글로치디아’로 대체하여 잠재적 인혼란27,28로이어진다. 다른 애벌레 발달 단계를 특성화에 일관성의 부족은 일반적으로 애벌레 발달의 복잡성을 포괄하지 않는 ‘gravid’로 우울한 여성을 설명하는 많은 연구원을 떠났다. 호스트 물고기 실험을 실시 하는 생활 역사 연구 는 완전히 개발 된 glochidia와 gravid 여성에 대 한 필요성을 우선 순위를, 하지만이 정보는 출판 및 출판 되지 않은 문학 에 걸쳐 흩어져있다 29,30. 현재, 데이터는 계란, 미성숙한 glochidia, 호스트에 부착을 위한 준비된 완전히 개발된 glochidia 사이 전환의 타이밍을 포함하여 많은 홍합 종의 생식 습관에 관하여 부족합니다. 대부분의 종에 대 한, 그것은 불분명 얼마나 오래 암컷 무리 glochidia 그리고 얼마나 빨리 수정 계란 완전히 개발. 지식 격차는 종종 비 치명적인 효과 대 한 테스트 하 고 보충 하기 위해 과학 커뮤니티에 승진 될 수 있는 아가 미 콘텐츠를 추출 하는 표준화 된 방법에 대 한 필요성을 제시 하는 보존 관심사의 종에 대 한 더 넓은 주류 데이터 수집 방법론, 보호 인구에 위협을 포즈없이24,31,32.

이 연구는 세 가지 목표를 가지고 있었다: 1) 아가미 샘플링 기술을 공식화하고 그장에서 여성 홍합에 치명적이고 비 치명적인 효과를 테스트, 2) glochidial 개발의 다른 단계를 특성화하고 식별및 표준화 된 방법을 설명 3) 수집된 데이터에 대한 공용 저장소를 만듭니다. 현장 조사, 장기 모니터링 프로젝트 및 박물관 컬렉션은 모두 여기에 설명된 프로토콜이 구현될 수 있는 기회와 더 넓은 관심사를 위해 수집될 추가 데이터를 나타냅니다. 공식화된 프로토콜에는 애벌레 개발의 각 단계를 차별화하기 위한 시각적 개체 및 문자 설명이 포함됩니다. 범주를 표준화하여 수집된 결과를 모든 발생 및 종 간에 비교할 수 있습니다. 데이터가 수집되면 모든 것을 담수 홍합 중력 알마나크(FMGA)에 제출할 수 있으며, 이 프로토콜을 사용하여 수집된 중력 정보를 위한 데이터베이스입니다. 수집된 모든 중력 정보를 저장하고 컴파일하는 최종 제품은 향후 연구, 보존 및 복구 노력을 촉진하는 연구 도구를 제공합니다. 이 방법론을 다양한 홍합 프로젝트에 통합하고 FMGA에 데이터를 제출하는 것은 일년 내내 홍합 종의 중력 상태에 관한 지식의 폭을 확대할 것입니다. 매우 난해한 생물군으로서 민물 홍합의 생식 습관에 대한 이 프로토콜과 결과 데이터베이스는 인구 역학을 이해하고 이러한 종의 보존을 촉진하는 데 필수적입니다.

Protocol

1. 그라비드 여성 컬렉션 참고: 어류 및 야생 동물 서비스의 담수 홍합 조사 프로토콜33을 참조하여 멸종 위기에 처한 종에 대한 샘플링 사이트를 적절하게 조사하는 방법에 대한 지침을 참조하십시오. 적절한 연방 허가는 존재하는 모든 종에 대한 보호 종 및 주 허가의 필드 수집 전에 얻어야한다. 촉각-시각적 방법(단계 1.2)을 사용하여 현장에서 살아있는 홍합을 수집하거나 박물관에서 보존된 표본을 활용합니다(1.3단계).참고 : 탈수를 방지하고 스트레스를 줄이기 위해 수집 후 살아있는 홍합을 시원하고 젖은 상태로 유지하는 것이 중요하며, 암컷이 아가미 내용물34를조기에 방출하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 수집 중 육안 검사(예: 맨틀 루어, 응집물 등)나 수집 후 육안 검사(예: 내부를 보고 아가미가 팽창되었는지 확인할 수 있을 정도로 개방 밸브를 부드럽게 캐고 있음) 그림 1).참고: 종은 글로치디아가 때때로 두 개의 외부 아가미 (ectobranchus), 단지 2 개의 내부 아가미 (endobranchus) 또는 네 개의 아가미 (테트라 제누스)가 화성17이기때문에 화성 아가미 내에서 우울하게되는 방법에 따라 다릅니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며, 중력 암컷은 아가미 샘플링을 위해 실험실로 다시 이송될 수 있습니다. 그림 1: 부드럽게 캐고 개인을 엽니 다. 살아있는 홍합의 중력을 확인하려면 엄지 손가락(A)으로밸브를 부드럽게 열거나 조심스럽게 스펙큘럼 또는 역펜치를 사용하여 밸브(B)를엽니다. 이 방법과 관련된 주의 사항을 프로토콜에서 2.3 단계를 검토합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 밸브를 열고 아가미를 검사하여 보존 된 표본에 대한 육안 검사를 수행하여 개인이 중력 암인지 여부를 결정합니다(그림 2). 그림 2: 중력 암컷을 식별하는 방법. 암컷 홍합 marsupial 아가미는 암컷이 중력과 우울 할 때 팽창 나타납니다. 사진 A와 C는 측면 의 관점에서 아가미를 보여주고 사진 B와 D는 아가미의 복부 보기를 제공합니다. 빨간 상자는 그라비드 (A / B)와 중력 (C / D) 여성 Lampsilis 스트라미나 홍합의 차이를 강조하기 위해 아가미를 설명합니다. 개인의 총 길이는 79mm(A/B) 및 88mm(C/D)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 2. 길 콘텐츠 샘플링 참고: 이 프로토콜은 현장 및 실험실의 살아있는 홍합에서 샘플링이 발생하든 보존된 표본에서 발생하든 상관없이 조정할 수 있습니다. 1.5 mL 플라스틱 미세원원지 수집 튜브를 준비하여 멸균수 의 약 1 mL을 준비하면 아가미 함량이 추출35 또는 에탄올 (EtOH)의 24 시간 이내에 평가될 경우 샘플 평가가 수집 또는 아가미의 경우 24 시간 이내에 발생할 수 없습니다. 내용은 EtOH에 보존 된 박물관 표본에서 나온 것입니다. 글로치디아가 주사 전자 현미경(SEM) 이미징용인 경우 70% EtOH를 사용하고, 글로치디아가 유전자 검사에 사용될 경우 비변성 95% EtOH36을사용하십시오. 10 mL 주사기에 멸균 20G 베벨 팁 바늘 하나에 대한 종이 포장을 제거합니다. 캡을 풀면 바늘이 노출되고 아가미 함량 을 수집하기 위해 1.5 mL 플라스틱 튜브를 준비하십시오. 검은 색 스토퍼가 0 mL / cc 라인에 있도록 주사기의 핸들을 끝까지 아래로 밀어 넣습니다.참고: 아가미 내용물 샘플링할 때마다 멸균 주사기를 사용해야 합니다. 사용된 주사기는 팁을 10% 표백액에 담근 다음 멸균수 1mL로 채우고 플런저를 0 mL/cc로 다시 누핑하여 주사기를 헹구고 마지막으로 깨끗한 천으로 주사기를 건조시켜 현장에서 멸균할 수 있습니다. 그라비드 암컷을 집어 들고 엄지 손가락 끝을 사용하여 두 개의 밸브를 부드럽게 엽니다.주의: 동물에게 해를 끼치지 않도록 주의하십시오. 밸브를 너무 넓게 열거나 너무 빨리 열면 인덕터 근육이 과도하게 확장되어 사망을 초래할 수 있습니다. 얇은 껍질 표본 (예를 들어, 아노돈타, 렙토데아, Utterbackia등)과 젊은 개인은이 단계에서 특히 취약하다. 깨지기 쉬운 껍질을 벗긴 종을 강제로 다루면 껍질이 깨져 사망할 수 있습니다. 경우에 따라, 전방 및 후방 껍질 여백에서 얇은 껍질을 입은 동물을 압박하여 복부 표면을 보면서 껍질이 약간 구부러지고 틈이 생겨 아가워서 아가미를 관찰하거나 껍질을 열고 깨지기 쉬운 동물을 손상시키지 않도록합니다. 쉘 마진을 가합니다.참고: 도구는 이 단계를 지원하는 데 사용할 수 있지만 주의와 함께 사용하지 않으면 사망을 초래할 수 있으며 가능하면 피해야 합니다. 예를 들어, 스펙큘럼 또는 변형된 역펜치 세트는 개별 오픈을 캐고 데도움이 되는 데 사용될 수 있으며, 웨지는 밸브를 여는 데 도움이 될 수 있다. 다른 사람이 도움을 줄 수 있는 경우 이러한 기구가 필요하지 않을 수 있습니다(즉, 한 사람이 동물을 열고 다른 사람이 추출을 위해 주사기를 기동하는 동안). 손상 또는 periostracum에서 맨틀 조직을 분리하는 것은 성장 기형 및 사망을 일으킬 수 있습니다37; 따라서 맨틀 조직과 껍질의 외부 여백 사이의 연결을 끊는 것을 피하는 것이 중요합니다. 주사기의 바늘 끝을 사용하여 팽창 된 마수피 아가미의 단일 물 튜브를 부드럽게 관통하십시오. 다음으로, 바늘의 경사진 끝을 활용하여 아가미 내용물 밖으로 부드럽게 떠냅니다.참고 : 길 내용물 일반적으로 바늘의 경사진 끝에 볼 수 있어야 유백색 일관성을 가지고있다. 현미경을 쉽게 사용할 수 있는 경우 주사기의 내용물부분을 페트리 접시에 직접 보관하십시오. 그렇지 않으면, 함량을 1.5 mL 플라스틱 미세원원지 튜브에 지정된 액체(2.1단계 참조)로 보관하여 나중에 평가를 위해 보관한다.참고 : 손상 및 감소 생존을 방지하기 위해 운송 중 glochidia 샘플의 교란 및 처리를 최소화32,35. 속 종 식별, 중력 상태, 여성의 길이 (mm), 수집및 연락처 정보, 주, 카운티, 배수, 특정 수집위치, 위도 및 경도, 아가미에 대한 고유 식별자에 대한 기록 정보 조사 사이트의 고유 식별자, 아가미 내용이 추출된 경우 수집 일자(그림3). 운송 중에 정확한 데이터 기록을 보장하기 위해 각 수집 용기에 고유 식별자를 기록합니다. 신원 확인을 위해 홍합의 오른쪽 외부 밸브를 촬영하고 그림에서 읽을 수있는 고유 식별자로 표시된 튜브를 포함합니다. 선택적으로, 홍합이 발견된 환경 및 커뮤니티에 대한 정보를 보완하기 위해 다른 비생물학적 및 생물학적 파라미터를 수집한다(제안에 대한 그림 3 참조). 그림 3: 필드 중력 데이터 시트의 예입니다. 신뢰할 수 있는 정보를 생성하기 위해 아가미 샘플을 채취한 경우 정확한 데이터 보고가 필요합니다. 이는 각 아가미 샘플과 함께 수집할 최소 필드와 추가 생체 매개변수가 있는 필드 데이터시트의 예입니다. 보다 포괄적인 정보는 프로토콜의 4.1 단계를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 3. 아가미 내용물의 실험실 평가 아가미 내용물이 1.5 mL 튜브에 있는 경우, 페트리 접시에 옮기고 접시 바닥을 물로 채웁니다. 페트리 접시를 원을 그리며 부드럽게 돌리면 접시 중앙에 내용이 섞여 서서히 시료를 더 집중하게 볼 수 있습니다.참고: 1.5mL 튜브는 아가미 내용물이 튜브 벽에 달라붙는 경우 분출병을 사용하여 플러시하거나 물로 채워진 이송 피펫을 사용해야 할 수 있습니다. 페트리 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 샘플을 평가합니다. 가능하면 현미경으로 아가미 샘플의 사진을 찍어 해당 샘플에 대한 고유 식별자로 레이블을 지정합니다. 각 아가미 샘플에 존재하는 발달 단계의 결과를 기록합니다. 그림 4를 가이드로 사용하여 각 개발 단계를 특성화합니다. 어떤 경우에, 여성은 여러 발달 단계에서 유충을 우울 수 있습니다; 따라서 주어진 샘플 내에서 관찰된 모든 발달 단계를 보고합니다(예: ‘EGG/DG/IMG/FDG’). 보존된 글로치디아가 평가되면 섹션 4로 진행합니다. 완전히 발달된 글로치디아가 확인되고 EtOH가 보존에 사용되지 않은 경우, 3.3단계로 진행한다.참고 : 계란, 계란 질량; DG, 글로치디아 개발; IMG, 미성숙 글로치디아; FDG, 완전히 개발 된 글로치디아. 그림 4: 화성 아가미에서 글로치디아 개발의 다양한 단계에 대한 표현. (A)계란 덩어리 (EGG)는 계란을 함께 뭉게하는 막이 있습니다. 각 계란 막 안에는 분화 세포의 불투명한 구형 질량이 있습니다. 불투명 구형 질량은 초기 세포 분열 도중 다중 구형 질량으로 분할될 수 있습니다 그러나 명백한 바이밸브 모양이 관찰될 때까지 EGG로 아직도 기록되어야 합니다. (B)미성숙 글로치디아(IMG)는 난자 막 내에 함유된 뚜렷한 바이밸브 모양의 질량을 갖는다. (C)개발 글로치디아 (DG)는 뚜렷한 바이 밸브 모양, 계란 막 및 조직되지 않은 조직을 가지고 있으며 종종 외관이 흐릿합니다. NaCl에 노출되고 데이터가 기록될 때 ‘DG(T)’로 분류될 때 개발 글로치디아(DG)는 반응하지 않습니다. (D)완전히 개발 된 글로치디아 (FDG)는 뚜렷한 바이 밸브 모양과 명백한 adductor 근육 조직을 가지고 있어 글로치디아가 닫힙니다. 완전히 개발된 글로치디아(FDG)는 보존 후 두 개의 개방 밸브로 관찰되는 경우가 많습니다. 두 개의 열린 밸브는 일반적으로 NaCl에 노출될 때 닫히거나 닫히거나 닫히며 ‘FDG(T)’로 분류됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 질시료(35)의서브셋 액적에 NaCl의 결정을 첨가하여 완전히 개발된 글로치디아의 생존가능성을 더욱 평가하기 위해 염화나트륨(NaCl) 시험을 실시한다. 실행 가능한 글로치디아는 열린 위치에서 밸브를 닫아 NaCl에 응답합니다. 데이터가 기록될 때 지정 끝에 ‘(T)’로 소금 테스트를 거친 글로치디아를 보고합니다.참고 : 완전히 개발 된 글로치디아는 NaCl에 노출되지 않고 적극적으로 열리고 닫혀 있는 것을 관찰 할 수 있습니다. 4. 데이터베이스에 보고하기 액세스 FMGA 웹 (http://arcg.is/089uee), 온라인 소프트웨어 프로그램을 사용하여 개발 된38,39,40. FMGA 페이지는 데스크톱 데이터 입력 양식에 대한 링크와 모바일 장치에 대한 응용 프로그램 다운로드를 제공합니다. 모바일 앱을 사용하면 현장에서 데이터를 입력하고 자동 지리 참조41을사용할 수 있습니다.참고 : 민물 홍합 종 생활 역사 이벤트와 관련된 중력 달력 및 기타 그래픽은 FMGA 대시보드에서 찾을 수 있습니다. 모바일 앱 또는 데스크톱 사이트를 사용하여 드롭다운 메뉴 및 텍스트 입력 필드를 사용하여 데이터 입력 양식의 결과를 기록합니다. 기존에 큰 데이터 집합의 경우 템플릿 스프레드시트에 대해 작성자에게 문의하십시오. 스프레드시트의 각 레코드 또는 행이 한 중력 개인의 아가미 샘플 관찰을 나타낸다는 점을 염두에 두고 적절한 열 머리글 아래에 기록된 데이터를 입력합니다. 결과를 제출하면 관리자의 유효성을 검사한 후 FMGA 데이터베이스에 추가되며, 관리자가 수집가에게 연락하여 자세한 내용이나 사진을 요청할 수 있습니다.참고: FMGA 데이터베이스에서 데이터의 유효성을 검사하고 컴파일하면 FMGA 대시보드에 표시되는 모든 중력 달력 및 기타 대화형 그래픽이 업데이트됩니다.

Representative Results

이 프로토콜은 2015년 1월부터 2015년 12월까지 750m2 길이의 브루스 크릭(플로리다 주 월튼 카운티)에서 담수 홍합 커뮤니티를 모니터링한 캡처 마크 탈환 연구 중에 적용되었습니다. 현장 샘플링은 4주마다 수행되도록 예정되었습니다. 그러나 2015년 4월이나 9월에는 고유동성 이벤트로 인해 샘플링이 실시되지 않았습니다. 미국 지질 조사, 미국 어류 및 야생 동물 서비스, 플로리다 어류 및 야생 동물 보호위원회를 포함한 주 및 연방 기관은 현장 조사 및 아가미 샘플링을 지원했습니다. 조사 중에 만난 각 그라비드 암컷은 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 현장 아가미 함량 샘플링을 실시하고, 태그(재료 표참조)를 지정하고, 강 기판에 다시 배치하였다. 아가미 샘플은 95% EtOH에 저장되어 아가미 함량 평가를 위해 미국 지질 조사의 습지 및 수생 연구 센터의 실험실로 이송되었습니다. 여성을 태깅하고 일년 내내 매월 간격으로 다시 캡처함으로써, 우리는 총 90 명의 개인에 아가미 샘플링 프로토콜의 치명적및 비 치명적인 영향을 모두 평가했다. 이 연구 기간 동안 다음과 같은 7종은 탈환되었다: 엘리피오 풀라타 (n = 5), 푸스코나이아 버키 (n = 1), 하미오타 오스트랄리스 (n = 19), 오보바리아 촉타벤시스 (n = 1), 스트로피투스 윌리엄슨 (n = 1), 빌로사 리노사 (n = 60), 및 빌로사 바이벡스 (n = 3). 우리의 샘플링은 총 길이 24mm에서 80mm에 이르는 개인과 미국 멸종 위기 종법에 의해 보호되는 두 종(F. burkei 및 H. australis)을포함했습니다. 이 연구에 활용된 모든 데이터는 공개적으로 사용할 수 있으며 ScienceBase(https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)42에대한 데이터 집합에 대한 액세스를 제공했습니다. 생존은 아가미 샘플 수집 후 얼마나 많은 사람들이 살아서 탈환되었는지에 의해 평가되었습니다. 우리는 높은 생존을 관찰 (97%) 일부 사망률을 가진 연구 기간 동안, 아마도 포식에 반대, 현장 관찰에 의해 표시. 결과 보여주었다 약 51% 개인의 (46 의 90) 연속 샘플링 이벤트 사이 gravid 유지 발견 되었다. 개인의 또 다른 10 %(90의 9)는 중력을 발견하고, 중력하지 탈환하고, 다시 중력을 발견했다. 이 연구에서 개인의 약 39 %(90의 35)는 gravid를 발견했다, 아가미 샘플은 찍은, 하지만 일년 내내 다시 탈환 할 때, 그들은 두 번째 gravid을 발견하지 않았다. 결과는 여기에 기술된 프로토콜이 치명적이거나 치명적이지 않으며 아가미를 샘플링한 후 현재 의류 기간을 실질적으로 방해하지 않는다는 것을 나타냅니다. 이 연구에서 샘플 크기는 종에 걸쳐 불평등하지만,이 연구의 결과는이 프로토콜의 유익하고 실용적인 응용 프로그램을 강조합니다. V. 리노사에 대한 중력 달력은 FDG를 우울 하게 하는 그레이비드 암컷이 EGG를 우울하게 하는 암컷만 이 발견된 8월을 제외한 거의 매달 발견되었습니다(그림5A). 암컷 H. 오스트랄리스는 7월, 8월, 12월에 그라비드(NG)가 없는 것으로 나타났다. 여성의 더 큰 비율은 1 월과 2 월에 FDG우울했지만 10 월과 11 월에 발견되었다(그림 5B). E. pullata의 어떤 개별은 암컷이 5월에서 6월까지 EGG를 우울하고 있었지만 FDG를 우울하게, 그리고 6월에 기록된 1명의 gravid 여성 (GFR)는(그림 5C)를발견했습니다. 유일한 gravid F. 버키 여성은 6 월에 GFR을 발견하고 7 월에 NG를 탈환했다. 같은 O. 촉타웬시스 개인은 2월에 FDG를 수집하고 7월에 NG를 탈환했다. S. Williamsi는 단 한 번만 발견되어 세 번 이나 탈환되었습니다. 이 암컷은 3월에 FDG, 5월에NG, 6월에는 GFR, 8월에는EGG(그림 5C)에서발견되었다. V. 바이브스 우울 FDG의 그라비드 여성은 2 월과 6 월 사이에 발견되었다(그림 5C). 그림 5: 브루스 크릭, 플로리다에서 의 연구 결과는 중력 달력 형식으로 표시. (A) 빌로사 리호사 캡처/탈환에 대한 중력 달력. (B) 하미오타 오스트랄리스의 중력 달력 캡처/탈환. (C)샘플링 된 10 명 미만의 모든 종에 대한 중력 달력. y축에는 1월(Ja), 2월(F), 3월(Mr), 5월(내), 6월(Jn), 7월(Jl) 8월(A), 10월(O), 11월(N) 및 12월(D)의 약어가 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

중요성

임페실 종의 보존은 현존하는 인구 내에서 성공적인 모집에 달려 있습니다. 경우에 따라, 인공 전파는 위험에 처한 인구의 모집을 보강하기 위해 필요할 수 있습니다. 이를 위해서는 연구원들이 각 종에 대한 활발한 번식 시기에 대한 정보를 얻고 채용에 미치는 영향을 완화하기 위해 다양한 방법론이나 관리 관행을 적용할 수 있어야 합니다. 유기체의 불굴의 그룹으로, 생식 습관을 공부하기위한 표준화되고 치명적이지 않은 접근 방식을 확립하고, 데이터를 컴파일하고 시각화하여 과학 커뮤니티에 최신 정보를 제공하는 플랫폼을 제공하는 것이 가장 중요합니다. 정보를 사용할 수 있습니다. 이 연구는 예방 조치를 취하도록 보장하는 단계별 프로토콜을 제공하며, 아가미 함량은 여성 홍합에서 적절하게 샘플링되고 평가될 수 있습니다. 이 프로토콜은 치명적이고 비 치명적인 효과에 대해 테스트되었으며, 연구원과 관리자는 이 방법론을 책임감 있게 구현할 수 있었습니다. 또한 공개적으로 사용 가능한 사용자 친화적인 대시보드에서 중력 정보를 쉽게 컴파일할 수 있도록 데이터베이스 관리 도구 및 응용 프로그램 제품군을 개발했습니다. 역학, 글로치디아 형태학, 생명력, 계통 유전학, 전파 및 전좌에 대한 연구는 모든 민물 홍합의 모든 종에 대한 시간적 중력 정보의 저장소를 이용하여 활용할 수 있습니다.

이 연구 만으로도 일부 종의 생식 습관에 대한 이전 연구 결과를 지원했지만 다른 종에 대한 새로운 정보도 밝혀졌습니다. V. 바이벡스는 V. lienosa보다적은 수로 수집되었지만, 중력 데이터를 기반으로 둘 사이에 유사성을 찾을 수 있습니다. 빌로사의 두 종은 한 해 의 상당 부분 동안 완전히 개발 된 글로치디아를 무리처럼 보이며, 이는 겨울을 즐기는 무리로 특징지습니다. 이것은 다른 빌로사 종43,44,45에대한 이전 연구와 일치합니다. 이 연구의 결과는 H. australis가 12 월에 중력을 발견하지 않은 것을 제외하고는 10 월부터 6 월에 6 월에 gravid를 찾을 수 있음을 시사합니다. 이전에 간행된 연구 결과는 4 달의 중력 기간을 가진 congener H. altilis를 확인했습니다, 3월에서 6월46,47. 이 발견은 이전에 생각했던 것보다 더 긴 중력 기간을 설명하고 일반적으로 겨울 우울로 H. australis를 그룹화합니다. 연방 보호 종으로, H. altilis와 H. australis에 대 한 다양 한 우울 기간 생식 활성 시간 동안 인구를 더 나은 보호 하기 위해 관리 결정에 영향을 미칠 수 있습니다. Elliptio pullata는 매우 짧은 우울 기간24,48,49와빈시 종으로 자신의 특성에 해당 5 월과 6 월에 EGG와 gravid발견되었다, 50. 이 프로토콜을 사용하여 Elliptio 종에 데이터가 컴파일되므로 글로시디아가 1년 중 몇 개월 밖에 발견되지 않았기 때문에 특정 글로시디얼 개발 단계가 타겟팅될 때 자세한 정보가 현장 노력을 보다 효율적으로 만들 수 있습니다. 표본 크기가 낮은 다른 종의 추론은 제한적이지만 데이터가 데이터베이스로 컴파일될 수록 샘플 크기가 높을수록 추가 홍합 종의 생식 습관에 대한 통찰력을 제공합니다.

절차 적 의견

민물 홍합과 그들의 글로치디아는 인위적 스트레스에 취약한 것으로 알려져 있다10,35. 중력 검사 중에 홍합 밸브가 열리기가 쉽지 않을 수 있으며 부주의하게 밸브를 강제로 열어 두면 의도하지 않은 손상을 입히고 스트레스나 사망을 초래할 수 있습니다. 일부 깨지기 쉬운 껍질 종 (예를 들어, 아노돈타, 렙토데아, Utterbackia등)과 작은 크기의 개인은 쉽게 부서지고 찢어 질 수있는 매우 깨지기 쉬운 껍질과 약한 도우미 근육을 가질 수 있습니다. 가공이 책임감 있고 신중하게 수행되지 않으면 Gill 샘플링이 스트레스로 간주될 수 있습니다. 이전 연구는 생식 활성 시간 동안 홍합의 취급 및 공중 노출이 아가미 내용물의 조기 방출을 포함하여 다양한 생리적 스트레스를 일으킬 수 있음을 발견34. 그러나, 여기에 설명된 바와 유사한 방법론을 이용한 연구는, 아가미 샘플링 동안 그라비드 암컷 홍합을 취급하는 것이 현재의 무리를 방해하거나 단기 및 장기 우울 종 모두에서 조기 방출을 일으키지 않았다는 것을발견하였다 16. 게다가, 멸균 주사기는 다중 개별의 아가미를 뚫을 때 의도하지 않은 감염 또는 교차 오염을 방지하기 위하여 이 프로토콜 도중 이용될 필요가 있습니다. 또한 글로치디아는 깨지기 쉽고 무리는 성숙하고 스트레스를 받을 수 있지만 추방되지는 않습니다. 가난한 건강에 성숙한 glochidia 소금 테스트에 반응 하는 적은 개인 귀 착될 수 있다35. DG(T)와 FDG(T)를 구별할 때는 큰 샘플 크기의 염분 검사를 하는 것이 중요하며, 이 연구에서 제공된 설명을 사용하여 DG와 FDG 글로치디아의 차이를 신중하게 식별하기 위해 관찰에 대한 메모를 합니다. 적절한 관리를 취할 때, 이 절차에 의해 유도된 최소한의 스트레스는 여성 홍합이 자연스럽게 글로치디아를 우울하게 계속하고 인구모집에 미치는 영향을 줄일 수 있습니다.

추가 데이터를 기록하여 데이터베이스를 보완하고 담수 홍합의 생식 습관에 대한 광범위한 컨텍스트를 제공할 수 있습니다. 일부 종(예를 들어, 푸스코나이아종)은글로치디아(51)의개발 단계에 기초하여 상이한 색의 아가미를 가지는 것으로 관찰되었다. 여성의 초기 중력 검사 동안, 아가미 색에 대한 설명은 향후 조사를 허용하기 위해 보고 된 데이터에 포함 될 수있다. 또한, 프로토콜의이 시점에서, 연구원은 우울한 여성이 두 개의 외부 아가미 (ectobranchus), 두 개의 내부 아가미 (endobranchus) 또는 모든 4 개의 아가미 (테트라 제누스)17에서우울한 글로치디아를 발견했는지 여부를 알 수 있습니다. 이 정보는 FMGA에 추가될 수 있으며 조사된 각 종에 대한 우울에 관한 데이터 격차를 채우는 데 도움이 됩니다. 환경 조건, 특히 수온은 다양한 위도 범위에서 종의 중력 상태와 타이밍을 보다 포괄적으로 관찰하기 위해 현장에서 수집 및 기록할 수 있습니다. 연구에 따르면 온도, 포토기간, 유량 및 식품 가용성과 같은 환경 매개 변수는 담수 홍합52,53,54,55에서 생식 이벤트를 유발할 수 있습니다. ,56. 추가 필드는 그라데이티에 영향을 미치는 비생물 적 요인에 대한 미래 연구를 촉진하기 위해 제출될 때 데이터베이스에 추가 될 수 있습니다. 우리의 연구 결과 후에 모델링된 캡처 마크 재캡처 수정은 또한 연구원이 특정 홍합의 생식 습관을 감시하고 해마다 다중 무리에 대한 정보를 공개하는 것을 허용하는 이 프로토콜에 추가될 수 있습니다.

FMGA의 정보의 정확성은 소스에 따라 다릅니다. 예를 들어, 담수 홍합의 오인은종 57을구별하기 어렵게 만드는 유사한 외부 특성을 갖는 많은 종으로 인해 일반적이다. 잘못 식별 된 개인의 아가미 샘플은 종의 우울한 기간에 대한 혼란과 거짓 정보를 만들 수 있습니다. 아가미 샘플을 채취한 경우, 오른쪽 밸브 외부의 두 밸브 내부(개인이 살아 있지 않은 경우) 내부의 사진을 찍고, 움보(두 개의 밸브가 연결되는 경첩)를 촬영하고 데스크탑 사이트 또는 모바일 애플리케이션을 통해 중력 데이터로 제출해야 합니다. 우리는 또한 아가미 내용물의 사진을 환영합니다. 제출 양식에는 드롭다운 메뉴가 있어 수집가가 종 식별에 대한 신뢰도를 나타낼 수 있습니다. 레코드의 유효성이 검사되기 전에 이 정보는 그럴듯한 배포 등에 대한 수집기 식별을 확인할 때 고려됩니다. Unionidae의 종에 있는 intraspecific 형태학적 인 변이의 높은 수준으로 인해, 조직 견본의 제출은 격려되고 분자 식별을 촉진하기 위하여 필요할 지도 모릅니다.

미래의 영향

비 치명적인 방법으로, 이 프로토콜은 일반적인 및 임페실 종 모두에 적용될 수 있습니다. 멸종 위기에 처한 종에 대한 중력 달력은 멸종 위기에 처한 종 법규 및 복구 계획과 관련된 보존 관리자를 지원할 수 있습니다. 위험에 처한 종을 관리하는 주 및 연방 기관은 종들이 취약하고 재생되지 않는 시기에 대한 할당을 더 잘 조언할 수 있으며, 홍합이 완전히 개발된 글로치디아를 우울하게 하는 시기에 호스트 물고기의 수확을 제한할 수도 있습니다. 또한 현장 조사는 비생식 기간 동안 종을 타겟팅하여 채용 프로세스에 미치는 영향을 최소화할 수 있습니다. 공개적으로 액세스할 수 있는 데이터베이스인 FMGA는 연구원과 관리자가 대상 담수 홍합 종에 대한 중요한 생식 정보를 얻을 수 있는 도구를 제공합니다. 또한 데이터베이스는 데이터 격차를 강조하여 종별 우울 패턴에 대한 추가 연구를 장려합니다. 종의 생식 패턴을 이해하면 적절한 관리 결정을 내릴 수 있으므로 프로토콜과 데이터베이스가 미래의 담수 홍합 연구, 보존 및 복구를 용이하게하기를 바랍니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 자금 출처에 감사하고 싶습니다: 미국 어류 및 야생 동물 서비스 및 미국 지질 조사. 데이터베이스 개발에 대한 귀중한 공헌에 대한 로렌 패터슨과 크리스 앤더슨과 함께 현장 승무원 및 데이터 수집을 조직하기위한 앤드류 하트 조그와 산드라 Pursifull에 특별한 감사. 셰리 보스틱, 마크 캔트렐, 사할레 케이스볼트, 조던 홀콤, 하워드 젤크스, 게리 마혼, 존 맥레오드, 카일 문, 카일 문, 카일 모닝스타, 엠마 피스톨, 맷 로우, 채닝 스트리트 등 현장과 실험실에서 도움을 주신 모든 분들께 감사드립니다. 오빈, 짐 윌리엄스. 무역, 회사 또는 제품 이름을 사용하는 것은 설명적인 목적으로만 사용되며 미국 정부의 승인을 의미하지는 않습니다.

Materials

1.5 mL snap cap centrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost.
20 G needle on 10 mL disposable syringe Exelint International 26255 sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2"
Dissecting Microscope any any
Marking Pen Fisher Scientific 13-379-4 This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof.
Molecular grade ethanol any any Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work.
Paper any any Needed to record information on samples collected.
Pen/pencil any any If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine.
Petri dish DWK Life Sciences (Kimble) 23000-9050 This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used.
Sodium Chloride any any Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this.
Speculum any any Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.
Sterile water any any Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection.
Super glue Gorilla Gorilla super glue gel Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Tags Hallprint FPN 8×4 Only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Transfer Pipet Thermo Scientific Samco 225 This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable.
Tweezers any any Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this.
Waterproof paper RainWriter any Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from.
Wooden pick any any Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.
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References

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Beaver, C. E., Geda, S. R., Johnson, N. A. Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida). J. Vis. Exp. (152), e60244, doi:10.3791/60244 (2019).
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