JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
English

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

손 수분, 현미경 검사법 및 유전자 분석을 결합한 살구의 자기 및 간 호환성 관계 결정

Published: June 16, 2020
doi:
10.3791/60241
, , ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM La Mayora-UMA-CSIC)

Summary

PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별과 형광 현미경 검사법에 의한 자기(in)호환성을 결합한살구(Prunus armeniaca L.) 품종의 수분 요건을 확립하는 방법론을 제시한다.

Abstract

Rosaceae의 자기 비호환성은 주로 다골 궤적 S에 의해 제어되는 게임토피틱 자기 비호환성 시스템(GSI)에 의해 결정됩니다. 살구에서, 새로운 품종의 중요한 수의 방출이 알려지지 않은 수분 요구 사항을 가진 품종의 증가를 초래했기 때문에 자기 및 인터 -(in) 호환성 관계의 결정은 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기서는 PCR 분석에 의한 S-유전자형식별과 손-오염 및 현미경 검사법에 의한 자기(in)호환성의 측정을 결합한 방법론을 설명한다. S- 자기(in)호환성 측정을 위해 각 품종의 풍선 스테이지에서의 꽃은 현장에서 수집되고, 실험실에서 수분, 고정 및 형광 현미경 검사하에 꽃가루 튜브 거동을 관찰하기 위해 애니라인 블루로 염색하였다. 품종 간의 비호환성 관계의 설립을 위해, 각 품종에서 DNA는 젊은 잎에서 추출되었고 S-alleles는 PCR에 의해 확인되었다. S 이 접근 법은 비호환성 그룹을 수립하고 품종 사이의 비호환성 관계를 해명 할 수 있으며, 이는 새로운 과수원 설계에 적합한 수분제를 선택하고 번식 프로그램에서 적절한 부모를 선택하는 귀중한 정보를 제공합니다.

Introduction

자기 비호환성은 식물을 꽃피는 전략으로 자가 수분을 방지하고 횡단 을 촉진하는1을촉진합니다. Rosaceae에서, 이 기계장치는 주로 다발성 궤적 S2에의해 제어되는 게임토피틱 자기 비호환성 시스템 (GSI)에 의해 결정됩니다. 스타일에서, RNase 유전자는 S-s타이라 결정제, RNase3을인코딩하고, S-꽃가루결정제를 결정하는 F 박스 단백질은 SFB 유전자4에의해 명문화된다. 자가비호환성 상호작용은 배란5,,6의수정을 방지하는 스타일을 따라 꽃가루 관 성장의 억제를 통해 일어난다.

살구에서, 품종 갱신은 지난 2 년 동안 전 세계적으로 일어났다7,,8. 이러한 새로운 품종의 중요한 수의 도입, 다른 공공 및 민간 사육 프로그램에서, 알 수없는 수분 요구 사항8살구 품종의 증가를 초래했다.

살구의 수분 요구 사항을 결정하는 데 다른 방법론이 사용되었습니다. 현장에서, 자체(in)호환성은 케이지 나무 또는 에뮬레이트된 꽃에서 제어된 오염에 의해 확립되고, 이후에 과일 세트9,,10,,11,12의백분율을기록할 수 있다. 또한, 대조된 오염은 꽃의 반 생체 배양에 의해 실험실에서 수행되었으며 형광 현미경검사법 8,13,,,14, 15,,16,,17하에서꽃가루 튜브 거동을 분석한다.15, 최근에는 PCR 분석 및 시퀀싱과 같은 분자 기법은 RNase 및 SFB 유전자18,,19의연구에 기초하여 비호환성 관계의 특성화를 허용하고 있다. 살구에서, 33 S-alleles(S1 ~ S20, S22 ~ S30,S52, S53,Sv, S S Sx)자가 호환성(SSc)12,18,,20,,,21,21,,22,,23,,24. 지금까지, 26 비호환성 그룹은 S-유전자형8,9,,17,25,,,,26,,27에따라 이 종에서 찌르고 있다. 동일한 S-대립구를 S가진 품종은 상호 호환되지 않는 반면, 적어도 하나의 다른 S-대립구를 가진 품종및 결과적으로, 다른 호환되지 않는 그룹에 할당, 상호 호환됩니다. S

살구 품종의 수분 요구 사항을 정의하기 위해, 우리는 살구 품종에서 PCR 분석에 의한 S-유전자형의식별과 형광 현미경 검사법에 의한 자기(in) 호환성의 측정을 결합하는 방법론을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 비호환성 그룹을 설정하고 품종 간의 비호환성 관계를 설명할 수 있습니다.

Protocol

1. 자체(in) 호환성 결정 필드에 있는 꽃을 샘플링합니다. 원치 않는 이전 수분을 피하기 위해, 살구28에대한 BBCH 규모에 스테이지 58에 해당하는 풍선 단계(그림 1A)에서꽃을 수집 할 필요가있다. 실험실에서 자체 및 교차 pollinations 풍선 단계에서 꽃의 anthers를 제거하고 실험실 온도에서 건조 종이 조각에 배치?…

Representative Results

살구의 수분 연구는마취(그림 1A)가발생하기 하루 전에 늦은 풍선 단계에서 꽃을 사용해야 합니다. 이 단계는 꽃가루와 피스티트 컬렉션 모두에 가장 유리한 것으로 간주됩니다, 꽃 무늬 구조는 거의 성숙하기 때문에, 하지만 anther dehiscence는 아직 발생하지 않았습니다. 이는 폐쇄된 꽃잎이 외부 꽃가루를 운반하는 곤충의 도착을 방해하기 때문에 같은 꽃가루뿐?…

Discussion

전통적으로, 대부분의 상업 살구 유럽 품종은 자기 호환36이었다. 그럼에도 불구하고, 지난 수십 년 동안 번식 프로그램에서 부모로서 북미 자가 호환되지 않는 품종의 사용은 알 수없는 수분 요구 사항7,,8,,37새로운자기 호환 품종의 증가의 출시 결과. 따라서 살구 품종에서 의외의 호환성 관계의 결정은 점점…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 장관 드 시엔시아에 의해 투자되었다, 혁신시온 y Universidades-유럽 지역 개발 기금, 유럽 연합 (AGL2016-77267-R, AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y 알리멘타리아 (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); 고비에르노 데 아라곤-유럽 사회 기금, 유럽 연합 (그루포 콘솔리다 A12_17R), 펀다시온 바이오 다이버 시다드, 그리고 아로즈구로 S.A.

Materials

Agarose D1 Low EEO Conda 8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kit Bioline BIO-21060
Bright field microscope Leica Microsystems DM2500
CEQ System Software Beckman Coulter
DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN 69106
dNTP Set, 4 x 25 µmol Bioline BIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit – 400 Beckman Coulter 608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Beckman Coulter
GenomeLab Separation Buffer Beckman Coulter 608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1 Beckman Coulter 391438
HyperLadder 100bp Bioline BIO-33029
HyperLadder 1kb Bioline BIO-33025
Image Analysis System Leica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system  Bio-Rad 170-8640
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 13-400-518
pH-Meter BASIC 20 Crison
Phusion High-Fidelity PCR Kit Thermo Fisher Scientific F553S
Power Pack P 25 T Biometra
Primer Forward Isogen Life Science
Primer Reverse Isogen Life Science
Quantity One Software Bio-Rad
Stereoscopic microscope Leica Microsystems MZ-16
Sub-Cell GT Bio-Rad
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Taq DNA Polymerase QIAGEN 201203
Vertical Stand Autoclave JP Selecta
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silva, N. F., Goring, D. R. Mechanisms of self-incompatibility in flowering plants. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, 1988-2007 (2001).
  2. Charlesworth, D., Vekemans, X., Castric, V., Glémin, S. Plant self-incompatibility systems: A molecular evolutionary perspective. New phytologist. 168, 61-69 (2005).
  3. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38, 304-311 (1997).
  4. Ushijima, K., et al. Structural and transcriptional analysis of the self-incompatibility locus of almond: Identification of a pollen-expressed F-box gene with haplotype-specific polymorphism. The Plant cell. 15, 771-781 (2003).
  5. Bedinger, P. A., Broz, A. K., Tovar-Mendez, A., McClure, B. Pollen-Pistil Interactions and Their Role in Mate Selection. Plant Physiology. 173, 79-90 (2017).
  6. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: A review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  7. Zhebentyayeva, T., Ledbetter, C., Burgos, L., Llacer, G., Badenes, M. L., Byrne, D. Apricot. Fruit Breeding. , 415-458 (2012).
  8. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing Production in the New Generation of Apricot Cultivars: Self-incompatibility, S-RNase Allele Identification, and Incompatibility Group Assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
  9. Egea, J., Burgos, L. Detecting Cross-incompatibility of Three North American Apricot Cultivars and Establishing the First Incompatibility Group in Apricot. Journal of the American Society for Horticultural Science. 121, 1002-1005 (1996).
  10. Rodrigo, J., Herrero, M. Effects of pre-blossom temperatures on flower development and fruit set in apricot. Scientia Horticulturae. 92, 125-135 (2002).
  11. Julian, C., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower bud differentiation and development in fruiting and non-fruiting shoots in relation to fruit set in apricot (Prunus armeniaca). Trees. 24, 833-841 (2010).
  12. Muñoz-Sanz, J. V., Zuriaga, E., López, I., Badenes, M. L., Romero, C. Self-(in)compatibility in apricot germplasm is controlled by two major loci, S and M. BMC Plant Biology. 17, 82 (2017).
  13. Burgos, L., Berenguer, T., Egea, J. Self- and Cross-compatibility among Apricot Cultivars. HortScience. 28, 148-150 (1993).
  14. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot “Moniqui”. Journal of Horticultural Science. 71, 801-805 (1996).
  15. Milatović, D., Nikolić, D., Krška, B. Testing of self-(in)compatibility in apricot cultivars from European breeding programmes. Horticultural Science. 40 (2), 65-71 (2013).
  16. Milatović, D., Nikolić, D., Fotirić-Aksić, M., Radović, A. Testing of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Acta Scientiarum Polonorum, Hortorum Cultus. 12 (6), 103-113 (2013).
  17. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of Self-Incompatibility Alleles by Specific PCR Analysis and S-RNase Sequencing in Apricot. Int J Mol Sci. 19, 3612 (2018).
  18. Romero, C., et al. Analysis of the S-locus structure in Prunus armeniaca L. Identification of S-haplotype specific S-RNase and F-box genes. Plant Molecular Biology. 56, 145-157 (2004).
  19. Halász, J., Pedryc, A., Hegedus, A. Origin and dissemination of the pollen-part mutated SC haplotype which confers self-compatibility in apricot (Prunus armeniaca). New Phytologist. 176, 792-803 (2007).
  20. Halász, J., Hegedus, A., Hermán, R., Stefanovits-Bányai, &. #. 2. 0. 1. ;., Pedryc, A. New self-incompatibility alleles in apricot (Prunus armeniaca L.) revealed by stylar ribonuclease assay and S-PCR analysis. Euphytica. 145, 57-66 (2005).
  21. Vilanova, S., Romero, C., Llacer, G., Badenes, M. L., Burgos, L. Identification of Self-(in)compatibility Alleles in Apricot by PCR and Sequence Analysis. Journal of the American Society for Horticultural Science. 130, 893-898 (2005).
  22. Feng, J., et al. Detection and transcript expression of S-RNase gene associated with self-incompatibility in apricot (Prunus armeniaca L.). Molecular Biology Reports. 33, 215-221 (2006).
  23. Zhang, L., et al. Identification of self-incompatibility (S-) genotypes of Chinese apricot cultivars. Euphytica. 160, 241-248 (2008).
  24. Wu, J., et al. Identification of S-haplotype-specific S-RNase and SFB alleles in native Chinese apricot (Prunus armeniaca L). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 84, 645-652 (2009).
  25. Szabó, Z., Nyéki, J. Blossoming, fructification and combination of apricot varieties. Acta Horticulturae. 293, 295-302 (1991).
  26. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K. U., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135, 410-417 (2010).
  27. Lachkar, A., et al. Identification of self-(in)compatibility S-alleles and new cross-incompatibility groups in Tunisian apricot (Prunus armeniaca L.) cultivars. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 88, 497-501 (2013).
  28. Pérez-Pastor, A., Ruiz-Sánchez, M. C., Domingo, R., Torrecillas, A. Growth and phenological stages of Búlida apricot trees in South-East. Agronomie. 24, 93-100 (2004).
  29. Williams, J. H., Friedman, W. E., Arnold, M. L. Developmental selection within the angiosperm style: using gamete DNA to visualize interspecific pollen competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 9201-9206 (1999).
  30. Julian, C., Herrero, M., Rodrigo, J. Anther meiosis time is related to winter cold temperatures in apricot (Prunus armeniaca L.). Environmental and Experimental Botany. 100, 20-25 (2014).
  31. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A., Rodrigo, J. Lack of Fruit Set Caused by Ovule Degeneration in Japanese Plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  32. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower Emasculation as the Cause for Lack of Fruit Set in Japanese Plum Crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  33. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  34. Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil Starch Reserves at Anthesis Correlate with Final Flower Fate in Avocado (Persea americana). PLOS ONE. 8 (10), 78467 (2013).
  35. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through Identification, Characterization and cDNA cloning for S-RNases in Sweet Cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124, 224-233 (1999).
  36. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science. 72, 147-154 (1997).
  37. Hormaza, J. I., Yamane, H., Rodrigo, J., Kole, C. Apricot. Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants, Volume 4 Fruits and Nuts. , 171-187 (2007).
  38. Benmoussa, H., Ghrab, M., Ben Mimoun, M., Luedeling, E. Chilling and heat requirements for local and foreign almond (Prunus dulcis Mill.) cultivars in a warm Mediterranean location based on 30 years of phenology records. Agricultural and Forest Meteorology. 239, 34-46 (2017).
  39. Rodrigo, J., Herrero, M., Hormaza, J. I. Pistil traits and flower fate in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Applied Biology. 154, 365-375 (2009).
  40. Williams, R. R., Williams, R. R., Wilson, D. Techniques used in fruit-set experiments. Towards Regulated Cropping. , 57-61 (1970).
  41. Sutherland, B. G., Robbins, T. P., Tobutt, K. R. Primers amplifying a range of Prunus S-alleles. Plant Breeding. 123, 582-584 (2004).
  42. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8, 4321-4325 (1980).
  43. Porebski, S., Bailey, L. G., Baum, B. R. Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol Components. Plant Molecular Biology Reporter. 15 (1), 8-15 (1997).
  44. Rogers, S. O., Bendich, A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology. 5 (2), 69-76 (1985).
  45. Hormaza, J. I. Molecular characterization and similarity relationships among apricot (Prunus armeniaca L.) genotypes using simple sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics. 104, 321-328 (2002).
  46. Sonneveld, T., Tobutt, K. R., Robbins, T. P. Allele-specific PCR detection of sweet cherry self-incompatibility (S) alleles S1 to S16 using consensus and allele-specific primers. Theoretical and Applied Genetics. 107, 1059-1070 (2003).
  47. Hegedus, A., Lénárt, J., Halász, J. Sexual incompatibility in Rosaceae fruit tree species: molecular interactions and evolutionary dynamics. Biologia Plantarum. 56 (2), 201-209 (2012).
  48. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  49. Company, R. S. i., Kodad, O., Martí, A. F. i., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: From deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  50. Boskovic, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  51. Cachi, A. M., Wünsch, A. S-genotyping of sweet cherry varieties from Spain and S-locus diversity in Europe. Euphytica. 197 (2), 229-236 (2014).
  52. Zuriaga, E., et al. An S-locus Independent Pollen Factor Confers Self-Compatibility in “Katy” Apricot. PLoS ONE. 8 (1), 53947 (2013).

Tags

Self-compatibilityInter-compatibilityIncompatibilityApricotHand-pollinationMicroscopyGenetic AnalysisPollination RequirementsCultivar IdentificationIncompatibility GroupsSelf-incompatibilityFruit Tree CropsCherryPlumBBCH ScaleEmasculationPollen GerminationMicroscopyFixative SolutionEthanolPollen Germination MediumSodium SulfiteAutoclaving

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses. J. Vis. Exp. (160), e60241, doi:10.3791/60241 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image