メタ生物研究と保存のためのバイオレメディエーションおよびプロバイオティクス開発のための微生物株の探知

1. 微生物分離のための水とサンゴの収集と貯蔵 メモ:サンプリングサイトの座標と温度を取ることは不可欠です。可能であれば、湿度、pH、深さ、光強度などのメタデータは、微調整された栽培アプローチや将来のデータ解釈を見つけるのに役立ちます。信頼性の高い結果を得るには、サンプルを可能な限り長く保存しておきます。サンプルが適切な温度で保存されていない場合や、長期間保存されている場合、水/サンゴのマイクロバイオームはかなり変化する可能性があります。採取後すぐに隔離工程が行われない場合は、処理までサンプルを4°Cに維持することが重要です。サンプルが保存される時間が長ければ長いほど、4°Cであっても、微生物群集はより変化します。 海水をサンプルして保存します。 各標的サンプリング部位から少なくとも三重に水の500 mLサンプルを収集します。スクリューキャップ付きの滅菌ボトルを使用してください。 回収後すぐに水を処理する場合は、ボトルを短い間隔でRTに保ちます。サンプル処理が後で行う場合は、ボトルを4°Cに保ちます。 サンゴをサンプリングして保存します。 水サンプルの同じサンプリング部位からサンゴの断片をカットするために、無菌のペンチを使用してください。汚染を避けるために、無菌手袋だけでサンゴに触れます。 20mL滅菌生理食塩水(蒸留水中3%NaCl)または人工海水を使用してサンプルサンゴの断片をすすいで、海水の緩く付着した自由生菌を取り除きます。 鉗子を使用して、滅菌生理食塩水を含むスクリューキャップ付きの滅菌250-500 mL容器に各サンゴの断片を置きます。 実験室では、滅菌鉗子とペンチを使用して、計量スケールで無菌100ミリメートルx20ミリメートルペトリ皿を使用してサンゴの断片の5 gを重量を量る。 5gのサンゴ試料を滅菌モルタルに移し、滅菌害虫を使って黄斑する。 滅菌スパチュラを使用して、3%NaCl滅菌溶液の45 mLと5mmの10−15ガラスビーズを含む滅菌培養フラスコに浸漬サンプルを移します。 フラスコは、サンプリング部位の水温で16時間、一定の攪拌(150 x g)の下に保管してください。注:浅瀬サンゴの場合、最適な温度は24-28°Cの範囲です。このステップは、宿主細胞に取り付けられたものや、組織や骨格の中に生息するものなど、異なるサンゴのコンパートメントから微生物を切り離します。このステップの後、サンゴのマセレートを保存する必要があり、分離ステップを即座に実行する必要があります。 2. 海水やサンゴからのEE2分解細菌の分離 細菌を選択します。注:ステップ1.1.2および1.2.7の後、異なるサンゴの黄斑から切り離された海水中の微生物の濃度は不明で可変的です。寒天培地を含むペトリ皿の個々の微生物コロニーの分離を保証するためには、連続希釈が必要である。 サンゴのサンプルのための無菌生理食塩水で10-9までの連続希釈を行い、水のサンプルのための10-6まで。ピペット希釈は、先端を廃棄する前に5倍上下に希釈する。次のシリアル希釈を行う前に、毎回5sの渦サンプルを採取する。 3%NaClリソジェニースープ(LB)寒天培地を含むペトリ皿の各希釈のピペット100μL、およびそれらをプレート。注:海洋寒天(MA)を代替媒体として使用してください。各希釈の三重化は、信頼性の高い結果のために必要とされます。 目標温度(例えば、26°C)でプレートを1〜3日間インキュベートします。1日1回プレートを確認してください。 ストリークプレート技術を使用して、新しいプレート上で明確な成長形態を提示するコロニーを選択して分離します。プレート上に純粋なコロニーを成長させるために、必要な回数だけこの手順を繰り返します。 手順がステップ2.3.1に即座に継続されない場合は、セクション2.2で説明されているように、4°Cまたはグリセロールに分離物を保存します。 グリセロールストックを準備します。注:このステップはオプションであり、長期の細菌ストック貯蔵に使用できます。 新鮮なプレートまたは4°Cで保存されたプレートから単一のコロニーを選択し、滅菌LB培地の2 mLで独立して接種します。 チューブを一定の攪拌(150 x g)の下に24−28°C(ON)で置きます。 ステップ2.2.2から細菌培養物の1 mLを加え、2mLの凍結膜に20%の最終濃度に滅菌グリセロールを加えます。 凍結膜は4°Cのままにしておきます。 必要になるまで、グリセロール細菌ストックを-80°Cに置きます。 EE2-劣化能力試験を実行します。 LBブロスまたは代替メディアで分離をアクティブにします。このために、新鮮なプレートまたは4°Cで保存されたプレートから単一のコロニーを選択し、滅菌LB培地の2 mLを接種する。グリセロールストックの場合は、まずLB寒天プレートにストリークし、24-28°ONでインキュベートして、単一のコロニーを成長させます。LB培地を含むチューブを一定の攪拌(150 x g)下に24−28°CONに置きます。 細菌増殖後、細胞を8,000 x gで室温(RT)で8分間遠心分離してペレット化する。上清を捨て、上下に軽くピペットをして、生理食用水の等量(2mL)で細胞を再スレドし、残りのLBスープを洗浄する。 手順2.3.2を2回繰り返して、炭素源の痕跡がないことを保証し、細胞を同じ量の生理線溶液に再びサスペンドします。例えば、2 mL培養で開始された場合、細胞を2mL生理線溶液の最終体積で再中断する。 EE2を唯一の炭素源59として含有する最小ブッシュネルハース培養培地(BHブロス)で洗浄および再懸濁細胞を接種する。注:EE2は、培養培地中の5mg/Lの最終濃度でエタノールに溶解する。必要に応じて、汚染物質の種類や濃度を変更します。 LB寒天培地33上の600 nmおよび/またはコロニー形成ユニット(CFU)での光学密度によって細菌の増殖を評価し、16−72時間のインキュベーションを行う。注:あるいは、微生物は、EE2、または他の化合物を含む最小媒体上で直接炭素源として単離することができる。このステップは、選択を指示し、望ましくない成長を避けるだろう。 3. 海水やサンゴからの油分解細菌の分離 唯一の炭素源21として油水溶性画分(oWSF)および油水不溶性分率(oWIF)を含む最小媒体を調製する。 滅菌蒸留水の500 mLに1-2%の原油を加えます。底部に開いたフィルターフラスコを使用して、不溶性画分の上層を乱すことなく可溶性画分を取り出します。 混合物を150 x gで24−28°Cで48時間一定に保ちます。 原油分画を含むフィルターフラスコを安定した表面に置き、10~20分待って可溶性および不溶性画分分離を可能にします。 oWSFを新しい滅菌フラスコに移し、底部フィルターフラスコを開いて可溶性画分を取り出してoWIFを節約します。 前工程で回収したすべてのoWSF(〜400mL)を用いて、oWSFを含むBH寒天最小培地の1Lを唯一の炭素源として調製する。 ステップ3.1.4からフラスコに残っているoWIFを用いて、oWIFを含むBH寒天最小培地の1Lを唯一の炭素源として調製する。 oWSF-およびoWIF分解細菌を分離する。 ステップ1.1.2および1.2.7の水とサンゴのマセレートをそれぞれ使用して、ステップ2.1.1で説明したように滅菌生理食塩水溶液中のサンプルを10-6まで希釈します。 BH-oWSFおよびBH-oWIF寒天培地を含むペトリ皿の各希釈のピペット100°Lとそれらをプレート。 手順 2.1.3 からステップ 2.1.5 に記載されている手順を繰り返します。 4. コンソーシアム会員の選考 分類学的同定のためにDNAを抽出し、配列する。 ステップ2.3.1の説明に従って、グリセロールにストックされた分離をアクティブにします。 DNA抽出キットを使用して DNA を抽出します (材料表を参照)。 プライマー 27f (5′-AGA GTT TGA TCA TGT CTC AG-3) および 1492r (5′-GTT CTT GTT ACG ACT T-3′) を使用して、16S rRNA遺伝子を増幅します。 次のプロトコルに従って50μL PCR反応を行います:10xポリメラーゼバッファーの5 μL、2mM MgCl 2、0.2 mM dNTP、各プライマーの5mM、ゲノムDNAの10ng、およびTaq DNAポリメラーゼの2.5U。負のコントロール(すなわち、テンプレートDNAなしで空白のDNA抽出とPCR反応)を追加して、汚染がないことを確認します。 次のサーマルサイクリングステップを設定します:4分間94°Cで最初の変性サイクル。94°Cで35サイクル、1分間で50°C、2.5分で72°C。72 °Cで10分間の最終延長サイクル。 80 Vを使用して1.2%アガロースゲルのアンプリコンの完全性を確認します。 ゲル精製キットを使用してサンプルを精製します(材料表を参照)。 蛍光計を使用してPCR製品を定量化します。 優先順位のために製品を送信します。注: 分類分類を改善するには、長いシーケンスを提供するため、Sanger メソッドは60を推奨します。ユニバーサルプライマー27fおよび1492rは、16S rRNA遺伝子61のほぼ全長を増幅するために使用することができる。1 組のプライマーを使用してコンティグを組み立てることができない場合は、シーケンスの途中で余分なペアを考慮する必要があります。 成長曲線を決定します。 ステップ 2.3.1 で説明したように、ステップ 2.2.5 からグリセロールストック内の分離をアクティブにしますが、2 mL の代わりに 5 mL を使用します。 ステップ4.2.1から成長した5mL培養物の1%(v/v)を、3%LBメディアの100 mLを含む250 mLフラスコに加えます。負のコントロール(接種なし)の三重を準備してください。 フラスコをインキュベーターに入れ、一定の攪拌(150 x g)の24−28°Cに置きます。 48時間毎に1 mLアリコートを服用します。株が高い成長速度を示す場合は、4時間間隔を減少させる。 リッチメディアプレート上にめっきされたシリアル希釈から数えた600nm波長およびコロニー形成単位(CFU)での光学密度(OD)推定を測定する(100μLは各プレートに接種し、1mLの体積に正規化する必要があります)。 OD カーブと CFU カーブをプロットし、個々のひずみの OD/CFU の相関関係を解析します。今後は、OD 値に基づいてセルの数を計算します。 拮抗テストを実行します。 ステップ 2.3.1 の説明に従って分離をアクティブにします。 寒天培地を含むプレートの中央に沿って一度に1つの株を接種し、中央の1つに垂直な他の株を接種します。選択したすべての微生物株が他のすべての株に対してテストされるまで繰り返します。 プレートを24−28°Cでインキュベートし、拮抗活性を示す潜在的なハローを観察するために毎日監視します。2つの株間の拮抗活性を示すハローが観察された場合、そのうちの1つを除外する必要があります。 コンソーシアムアセンブリを実行します。 ステップ 2.3.1 の説明に従って分離をアクティブにします。 細胞を3,500 x gでペレットし、同じ量の生理線溶液で2倍軽く洗浄します。細胞を等しい体積で再中断します(つまり、最終体積が2mLの細胞であった場合は、2 mLの生理線溶液を使用して洗浄し、2 mLの最終体積で再中断します)。 100 mL 3% NaCl LB培地で1mL培養を接種し、150xgでオンをインキュベートする。 ステップ4.5.2を繰り返し、10L培養、洗浄、再懸濁培養物を10L培養して100mLに接種する。無菌エアリフトバイオリアクターでONをインキュベートし、ポンプから濾過空気を受け取ります。より多くの文化が必要な場合は、常に新鮮なメディアで成長した文化の1%を接種します。 遠心分離は8,000 x gで培養し、4分間で4分間栽培した。遠心分離後に上清を廃棄する。 ペレットを洗浄し、無菌生理食塩水の500mLで細胞を穏やかに再サスペンドする。 手順 4.5.5 と 4.5.6 を繰り返します。 各培養物を100mLの生理線溶液で再中断し、ODを測定して細胞数を推定する。 107細胞mL-1の最終濃度に到達するために必要な各培養の体積を計算する。 細胞の生存率と濃度の最終確認のためにリッチメディアでCFUカウントを実行します。 滅菌フラスコに各個々の培養物の等量を混合し、50 mLの無菌チューブにコンソーシアムをアリコートします。 接種するまで4°Cにしてください。注: セルが引き続き実行可能であることを保証するために、コンソーシアムアセンブリをできるだけ新たに準備します。あるいは、接種前にCFUカウントを実行することもできる。理想的なコンソーシアムを組み立てるには、異なる相補的な代謝能力を提示する単離性を使用する必要があります。通常、6 ~10 個の分離がコンソーシアムの形成に使用されますが、この数はメンバーの特性や目的によって異なります。 5. サンゴに対する有益な特性の検出 LB寒天プレートにストリークして24-28°Cでインキュベートし、単一のコロニーを成長させることで、グリセロールストックから分離物を有効にします。プレートから単一のコロニーを選択し、滅菌LB培地の2 mLでそれを接種します。一定の攪拌(150 x g)の下に傾斜したLB培地を含むチューブを24−28°CONに置きます。 PCRによる潜在的に有益な遺伝子の検出のために、セクション4.1に記載のDNA抽出を行う。注:PCR反応条件およびプライマーは標的遺伝子に依存する。個々の株のBMC特性を試験する方法論および潜在的に有益な遺伝子に対するPCR検出を表1に記載する。