JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

החיפוש אחר זנים מחיידקים לפיתוח בימתן ומוצרי פרוביוטיקה עבור המחקר והשימור של מטאפיאורגניזם

Published: October 31, 2019
doi:
10.3791/60238
, , , , , , ,
1LEMM, Laboratory of Molecular Microbial Ecology, Institute of Microbiology Paulo de Góes,Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2Genome Center,University of California, Davis, 3IMAM-AquaRio – Rio de Janeiro Aquarium Research Center

Summary

זיהום משפיע על כל biomes. סביבות ימיות מושפעים במיוחד, במיוחד שוניות אלמוגים, אחת האקולוגיות הרגישות ביותר על כדור הארץ. המשך הגישור הוא היכולת של אורגניזמים לבזות מזהמים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיות כדי לבודד ולבדוק חיידקים הצגת יכולת bioremediation ומאפיינים פרוביוטיקה פוטנציאליים עבור אלמוגים.

Abstract

זיהום משפיע על כל biomes. סביבות ימיות מושפעים במיוחד, במיוחד שוניות אלמוגים, אחת האקולוגיות הרגישות ביותר על כדור הארץ. באופן גלובלי, 4,500,000,000 אנשים תלויים כלכלית בים, היכן שרוב פרנסתם מסופקת על ידי שוניות אלמוגים. האלמוגים הם בעלי חשיבות רבה, ולכן ההכחדה שלהם מוביל להשלכות קטסטרופיות. ישנם מספר פתרונות אפשריים לתיקון מזהמים ימיים וזיהום מקומי, כולל בוררות. המשך הגישור הוא היכולת של אורגניזמים לבזות מזהמים. הגישה מציגה מספר יתרונות, כגון קיימות, עלות נמוכה יחסית, ואת העובדה כי ניתן ליישם בגורמים מסביבתיים שונים, גרימת השפעות מינימליות על הסביבה. כיתרון נוסף, מניפולציה של microbiomes אנדוגניים, כולל מיקרואורגניזמים מועילים לאלמוגים (pBMCs), ייתכן פרוביוטיקה אפקטים עבור בעלי חיים ימיים. בהקשר זה, השימוש בשתי הגישות, בוררות וגישור של pBMC, יכול להיות מבטיח. אסטרטגיה זו תקדם את ההשפלה של מזהמים ספציפיים שעלולים להזיק לאלמוגים ולמטאורגניזמים אחרים, תוך הגברת ההתנגדות והעמידות המארחים להתמודד עם זיהום ואיומים אחרים. שיטה זו מתמקדת בבחירה של pBMCs לבזות שני מזהמים: האסטרוגן סינתטי 17a-ethinyleEE2 לסטרנול (למעלה) ונפט גולמי. שניהם דווחו לפגיעה שלילית בבעלי חיים ימיים, כולל אלמוגים, ובני אדם. הפרוטוקול מתאר כיצד לבודד ולבדוק חיידקים המסוגלים לפגוע מזהמים ספציפיים, ואחריו תיאור של איך לזהות כמה מאפיינים מועילים של חיידקים אלה משויכים למארח האלמוגים שלהם. המתודולוגיות המתוארות כאן הן זולות יחסית, קלות לביצוע ומאוד מסתגלות. כמעט כל סוג של תרכובת היעד מסיסים ניתן להשתמש במקום EE2 ושמן.

Introduction

זיהום הוא סוגיה מרכזית המשפיעה על בריאות האדם, החי והצומח ברחבי העולם. למרות שזיהום יכול להיות טבעי, כגון אפר געשי1, הפעילות האנושית היא הגורם העיקרי לרוב הזיהום. פעילויות אנתרופוגניים מזהם אדמה, מים, אוויר, אשר במישרין או בעקיפין להוביל כמעט 20,000,000 מקרי מוות של בני אדם2 ולהשמיד מיליארדי צורות אחרות של החיים מדי שנה. גם באזורים הנידחים ביותר של כדור הארץ יש מזהמים. למשל, מתכות כבדות תרכובות אורגניות מתמשך זוהו יצורים חסרי חוליות בים העמוק יונקים קוטביים, בהתאמה3,4.

סביבות ימיות השפיעו במיוחד על ידי זיהום. במשך זמן רב, ההנחה היא כי האוקיינוס יישאר מושפע ולספק מקור אינסופי של סחורות בשל נפח מסיבי של מים5. מסיבה זו, כל סוגי התעשייה והמוסדות שחררו בחופשיות את הפסולת בגופי המים במשך מאות שנים6,7. כמה מזהמים מכל הסוגים, כגון פלסטיק8, הורמונים סינתטיים9, חומרי הדברה10, שמן11, חומרים מזינים12, מתכות כבדות3, ופסולת רדיואקטיבית13 דווחו כהשפיע . מערכות אקולוגיות באוקיינוס בהקשר זה, שוניות האלמוגים הן בין האקולוגית החשובה והרגישה ביותר בסביבות ימיות14. שוניות הם מגיני החוף, חיוני להתפתחות של אלפי מינים ימיים על ידי הפעלת תפקידים חיוניים בתחום התזונה ובקרת האקלים. השוניות תורמות גם לכלכלה על ידי מתן דגים, סחורות ותיירות, בין השאר15. למשל, 4,500,000,000 אנשים תלויים דגי ים כמקור המזון העיקרי שלהם16, אשר נתמך מאוד על ידי שוניות אלמוגים.

ללא קשר לחשיבות האקולוגית, החברתית והכלכלית שלהם, הושמדה שוניות אלמוגים17,18. פעילויות אנתרופוגניים אחראיות בעיקר לתרום לשלושת הגורמים העיקריים של מוות האלמוגים: שינוי האקלים, דיג יתר, זיהום מים19. למרות שחשוב לעבוד על ההקלה של התחממות כדור העולם, חשוב גם לעבוד על מזעור זיהום מקומי, כולל זיהום מים, כי יכול לתרום באורח קשה לירידה20האלמוגים. לפיכך, קיים צורך דחוף בפיתוח אסטרטגיות להגברת חיי האלמוגים, דבר שיכול לספק להם זמן נוסף כדי להסתגל ולשרוד.

בהקשר זה, חשוב מאוד למצוא פתרונות כדי למזער את הזיהום ולפתח אסטרטגיות כדי להגביר את כושר האלמוגים. אסטרטגיות לתיקון מזהמים ימיים הן מגוונות מאוד וניתן לקבץ אותן לגישות פיזיות, כימיות וביולוגיות. גישות פיזיות מועילות. עם זאת, הם לא תמיד יעילים. למשל, פסולת פלסטיק יכול להיות ממוזער על ידי הסרה פיזית, בעוד תרכובות מסיסים במים צריכים מתודולוגיות אחרות להימחק. דוגמאות של תרכובות כאלה הם נפט גולמי, שוחרר על ידי פעילות תעשיית הנפט נשפך, כמו גם מיקרו מזהמים אחרים, כגון הורמונים סינתטיים, משמש בדרך כלל כמרכיב אסטרוגניים בגלולות למניעת הריון וההווה ביוב21, 22. השימוש בחומרים כימיים כדי להקטין את הזיהום יכול לפתור בעיה ספציפית, אך הוא עשוי גם לייצג מקור נוסף לזיהום. זהו המקרה עם מפזרים כימיים להפחתת זיהום הנפט, אשר תוארו גם רעיל יותר מערכות אקולוגיות ימיות מאשר זיהום הנפט עצמו23. מסיבות אלו, גישות ביולוגיות מציגות מספר יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות. ביורגישור הוא היכולת של אורגניזמים חיים, או מוצרים מטבוליים שלהם, כדי להפוך את המזהמים לצורות פחות רעילים או לא רעילים24. היתרונות העיקריים של שימוש בשיטות ביולוגיות הם הקיימות, עלות נמוכה יחסית, העובדה שהם ידידותיים לסביבה, וכי הם יכולים להיות מיושמים בתוך מערכות אקולוגיות שונות, גרימת השפעות מינימליות או פחות לסביבת21, 25,26,27

בנוסף, מניפולציה של קהילת החיידקים המצויים בסביבה מאפשרת יתרון פוטנציאלי נוסף. ישנם microbiomes הקשורים עם מחשבים מארחים חיוניים לבריאותם. ידוע היטב כי אלה מיקרוביוomes סימביוטי הקשורים נחוצים כדי לשמור על הומאוסטזיס מארח19. מניפולציה של מיקרואורגניזמים אלה משויכים כבר נחקרו היטב עבור מחשבים מארחים כגון צמחים ויונקים28,29, אבל השימוש פרוביוטיקה קורל הוא עדיין רומן15. אלמוגים גם לארח, אינטראקציה עם, ותלוי באוכלוסיות גדולות וספציפיות של מיקרואורגניזמים לשרוד19. התפקיד של הקהילות האלה בבריאות ובדיסביוזיס של האלמוגים הוא תחת מחקר פעיל, אבל זה עדיין רחוק מלהיות מובנת לגמרי30. אחד ההשערות הפופולריות ביותר נקרא השערת פרוביוטיקה האלמוגים. היא מרמזת על קיומו של קשר דינאמי בין מיקרואורגניזמים סימביוטיים ותנאים סביבתיים המביאה לבחירת מטאורגניזמים האלמוגים הכדאית ביותר31. בהתבסס על מידע זה, מנגנונים פוטנציאליים מפתח פרוביוטיקה, כמו גם אסטרטגיות עבור בידוד, מניפולציה, ומסירה של מיקרואורגניזמים מועילים עבור אלמוגים (BMCs) למטרות מסוימות, הוצעו32 ו נבדק33. מאפיינים מועילים פוטנציאליים אלה כוללים עמידות לעלייה בטמפרטורה, הגנה מפני מינים של חמצן תגובתי (ROS), קיבעון חנקן, עמידות למזהמים, ושליטה ביולוגית נגד פתוגנים, בין היתר32.

מחקר זה מתמקד בבחירת BMCs ומיקרואורגניזמים חיים חופשיים המציגים את היכולת לבזות שני מזהמים בדרך כלל בסביבות ימיות: אסטרוגן סינתטי 17a-ethinyleלסטרנול (EE2) ונפט גולמי. מזהמים המכילים סוכנים פעילים הורמון לעתים קרובות נוכחים בגוף המים34,35,36,37,38,39,40, 41,42. ביניהם, אסטרוגניים מלאכותי האנדוקריניים תרכובות האנדוקרינית (EDCs) לחקות את הפעולה של אסטרוגנים על תאי היעד, גרימת מספר השפעות על בעלי חיים, כולל סרטן השד, פוריות, ו הרממיה9. EE2 מופרש על ידי בני אדם בגלל השימוש בגלולות למניעת הריון. הוא לא הוסר מן הביוב על ידי צמחים לטיפול שפכים מסורתיים יש השפעות שליליות גם בריכוזים נמוכים מאוד (למשל, ng/l או μg/l)43,44,45. מעט ידוע על ההשפעות של אסטרוגנים על קורל פיזיולוגיה46,47. עם זאת, על חסרי חוליות ימיים אחרים, כגון ספוגים, סרטנים, ו רכיכות, אסטרוגנים דווחו לגרום להשפעות שליליות בעיקר קשור רבייה, כגון פיתוח ו/או גירוי של gametes, שינוי אנזימטי ו פעולות חלבון, בעיות בתהליכים עובריים ואחרות48,49,50,51,52. ההשלכות השליליות נגרמת על ידי זיהום EE2 להדגיש את הצורך לפתח גישות קיימא להסיר את התרכובת מהסביבה מבלי להשפיע על החיים הימיים.

במקביל, עם שמן החשבונאי כיום עבור כמעט 40% ממקורות האנרגיה הנצרכים בעולם53, זיהום כרוני ודליפת שמן מתרחשים לעתים קרובות ליד אזורי השונית11. זיהום הנפט דווח לגרום להשפעות שליליות במספר מינים של בעלי חיים ימיים, ציפורים, צמחים, ובני אדם54,55,56,57. על אלמוגים, זה גורם הלבנת, מפחית את ההתנגדות של הזחלים ללחץ תרמי58, משבש את הקהילות הקשורות בחיידקים21, וגורם נמק ברקמות. בנוסף, מפזרים כימיים, טכניקת השיקום השמן הנפוץ ביותר על ידי חברות הנפט כדי לתיקון נשפך, הם רעילים אפילו יותר אלמוגים מאשר הנפט עצמו23. מיקרואורגניזמים מועילים המבודדים מאלמוגים, לעומת זאת, ידועים בתפקיד מכריע בבריאות המארחת. עם זאת, מניפולציה של מוצרי פרוביוטיקה פוטנציאליים אלה יש לחקור טוב יותר כדי לחקור תופעות לוואי שליליות אפשריות ואת יכולות חילוף החומרים שניתן להקרין כדי לשפר את הכושר של המטאורגניזם. בהקשר זה, מאפיינים כגון פעילות מיקרוביאלית נגד פתוגנים אלמוגים, הייצור של קטלאז להילחם בלחץ חמצוני, את היכולת לבזות אוריאה (אשר עשויים להיות תפקידים חשובים בתהליך הסתיידות), ונוכחות של גנים המקנים לתכונות מועילות פוטנציאליות, בין היתר, חייבת להיות מוקד החקירה. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בגישור ובאמצעות מוצרי פרוביוטיקה במקביל להפחתת ההשפעות של זיהום ושיפור בריאות האלמוגים. פיתוח גישות חדשניות שניתן להשתמש בהם כהתערבות כדי להגדיל את ההתמדה של מינים ימיים מייצגים צעד לקראת כוכב בר קיימא ובריא יותר.

Protocol

1. איסוף מים ואלמוגים לבידוד מיקרוביאלית הערה: חיוני לקחת את נקודות הציון והטמפרטורה של אתרי הדגימה. אם הדבר אפשרי, מטא-נתונים כגון מליחות, pH, עומק ועוצמת אור יכולים לסייע גם במציאת גישות טיפוח מכוונות ופרשנות עתידית של נתונים. לקבלת תוצאות אמינות, השאר את הדגימות המאוחסנות במשך הזמן המינימלי האפשרי. מיקרו-המים האלמוגים עשויים להשתנות במידה ניכרת אם הדגימות אינן נשמרות בטמפרטורה הנכונה ו/או מאוחסנות לפרקי זמן ארוכים. אם שלב הבידוד לא יבוצע מיד לאחר האיסוף, חשוב לשמור על הדגימות ב -4 ° צ’ עד לעיבוד. ככל שמדגמים מאוחסנים זמן רב יותר, אפילו ב-4 ° c, יותר הקהילה תשתנה. לדגום ולאחסן מי ים. לאסוף 500 mL דגימות של מים לפחות טרילקאט מכל אתר ממוקד. עדיף להשתמש בקבוקים סטרילי עם כובעי בורג. אם עיבוד המים מיד לאחר האיסוף, לשמור את הבקבוקים ב-RT עבור מרווח זמן קצר. אם עיבוד לדוגמה מתרחש מאוחר יותר, שמור את הבקבוקים ב-4 ° c. לדגום ולאחסן את האלמוג. השתמש זוג מעוקר של צבת לגזור שברי אלמוגים מאותו אתר דגימה של דגימות המים. כדי למנוע זיהום, לגעת באלמוגים רק עם כפפות סטרילי. לשטוף את רסיס אלמוג שנדגם באמצעות 20 מ”ל תמיסת מלח סטרילי (3% הנאגל במים מזוקקים) או מי ים מלאכותיים כדי להיפטר של חיידקים מחוברים באופן רופף חופשי של מי ים. באמצעות מלקחיים, מניחים כל רסיס אלמוג לתוך מכולה סטרילית 250-500 מ”ל עם כובע בורג המכיל תמיסת מלח סטרילי. במעבדה, באמצעות מלקחיים וצבת סטרילי, שוקל 5 גרם של שברי אלמוגים באמצעות מנות 100 מ”מ x 20 מ”מ של הצלחות פטרי במשקל. העבירו את 5 גר’ דגימת אלמוגים לחומר מליטה סטרילי, והשתמשו בו באמצעות מכתש סטרילי. באמצעות מרית סטרילית, להעביר את המדגם המעוקר לבקבוקון תרבות סטרילית המכיל 45 mL של 3% הפתרון סטרילי, 10-15 חרוזי זכוכית של 5 מ”מ. השתמש בחלק 45 mL תמיסת מלח סטרילי כדי לשטוף את החומר המליטה ולשחזר את הכמות המקסימלית של המקמרט. לשמור על מבחנות תחת עצבנות מתמדת (150 x g) עבור 16 h בטמפרטורת המים של אתר הדגימה.הערה: לאלמוגים במים רדודים הטמפרטורה האופטימלית היא בין 24 ל -28 ° c. שלב זה ינתק מיקרואורגניזמים מתאי אלמוגים שונים, כגון אלה המחוברים לתאים המארחים, או אלה החיים בתוך הרקמה והשלד. לאחר שלב זה, אין לאחסן את המאגנים האלמוגים, ולבצע את שלב הבידוד באופן מיידי. 2. בידוד של חיידקים EE2 משפילים ממי הים ו/או אלמוגים בחר חיידקים.הערה: לאחר שלבים 1.1.2 ו1.2.7, ריכוז המיקרואורגניזמים במי-ים שהתנתק מהמאכנים האלמוגים השונים, לא יהיו ידועים ומשתנים. כדי להבטיח את הבידוד של מושבות בודדות של חיידקים במנות פטרי המכילות מדיה אגר, יש צורך בדילול סדרתי. בצע דילול סדרתי עד 10-9 בתמיסה מלוחים סטרילית עבור דגימות אלמוגים ועד 10-6 עבור דגימות מים. פיפטה מדלל למעלה ולמטה 5x לפני מחיקת הקצה. דגימות וורטקס עבור 5 s בכל פעם לפני ביצוע הדילול הסדרתי הבא. פיפטה 100 μL של כל דילול על מנות פטרי המכילה 3% ציר הקימוט (LB) אגר בינוני, ולוחית אותם.הערה: השתמש ב-marine אגר (MA) כמדיום אלטרנטיבי. מטריפליטים של כל דילול נדרשים לקבלת תוצאות אמינות. מודאת הצלחות במשך 1-3 ימים בטמפרטורת היעד (לדוגמה, 26 ° c). . תבדקי את הצלחות פעם ביום בחר ולבודד את המושבות הצגת מורפולוגיות גדילה ברורים על לוחות חדשים באמצעות טכניקת לוח פס. חזור על שלב זה פעמים רבות ככל הנדרש כדי להיות מושבות טהור גדל על לוחיות. אם ההליך לא המשיך באופן מיידי לשלב 2.3.1, אחסן בודד ב -4 ° צ’ או בגליצרול כמתואר בסעיף 2.2. הכינו מניות גליצרול.הערה: שלב זה הוא אופציונלי וניתן להשתמש בו לאחסון מניות בקטריאלי לטווח ארוך. לבחור מושבות יחיד מן הלוח הטרי או מן הלוחות המאוחסנים ב 4 ° צ’ ובאופן עצמאי לחסן אותם ב 2 מ ל של מדיום ליברות סטרילי. מניחים צינורות תחת עצבנות מתמדת (150 x g) ב -24-28 ° c לילה (ב). להוסיף 1 מ ל של תרבויות חיידקיים משלב 2.2.2 וגליצרול סטרילי לריכוז הסופי של 20% ל 2 מ ל קריובקבוקונים. השאירו את הקריובקבוקונים. ב -4 ° c מניחים את המניות בקטריאלי גליצרול ב-80 ° צ’ עד הצורך. בצע את בדיקת היכולת EE2-השפלה. הפעל את הבודד בציר LB או במדיה חלופית. בשביל זה, לבחור מושבה אחת מן הצלחות טרי או את הצלחת המאוחסנים 4 ° c, ו האיחסן 2 מ ל של בינונית ליברות סטרילי. במקרה זה מלאי גליצרול, הראשון ברצף את זה בצלחות ליברות אגר ו-דגירה ב 24-28 ° צ’ על כדי להיות מושבות יחיד גדל. מניחים את הצינור המכיל LB בינוני בעצבנות מתמדת (150 x g) ב -24-28 מעלות צלזיוס. לאחר הצמיחה חיידקים, גלולה את התאים על ידי תפרידו אותם ב 8,000 x g עבור 8 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השמט את הסופרנטאנט ובעדינות ליטוף למעלה ולמטה, השהה מחדש את התאים בנפח שווה (2 מ”ל) של מים מלוחים כדי לשטוף את ציר ה-LB הנותר. חזור על שלב 2.3.2 פעמיים כדי להבטיח כי אין עקבות של מקור פחמן, להשעות את התאים בנפח שווה של פתרון מלוחים. למשל, אם זה התחיל עם תרבות 2 מ ל, להשעות מחדש את התאים בנפח הסופי של 2 mL תמיסת מלוחים. התחסן את התאים הנשטפים והמושהים באמצעי התרבות המינימלי של בושנל האס (BH ציר) המכיל EE2 כמקור הפחמן היחיד59.הערה: EE2 מומס אתנול בריכוז הסופי של 5 מ”ג/L במדיום התרבות. בצע שינויים בסוג הזהם ו/או בריכוז במידת הצורך. להעריך את הצמיחה חיידקים על ידי צפיפות אופטית ב 600 ננומטר ו/או המושבות להרכיב יחידות (CFU) על LB אגר בינונית33, עבור 16-72 שעות של דגירה.הערה: לחילופין, המיקרואורגניזמים יכולים להיות מבודדים ישירות על מדיה מינימלית המכילה EE2, או תרכובות אחרות, כמקור הפחמן היחיד. צעד זה יכוון את הבחירה וימנע צמיחה בלתי רצויה. 3. בידוד של חיידקים משפילים שמן מי ים ו/או אלמוגים הכנת מדיה מינימלית המכילה שבר שמן מסיסים במים (oWSF) ושמן בלתי מסיסים במים (Owsf) כמקור הפחמן היחיד21. הוסיפו 1-2% נפט גולמי ל 500 מ ל של מים מזוקקים סטריליים. השתמש בקבוקון מסנן נפתח בתחתית כדי לקחת את שבר מסיס מבלי להפריע את השכבה העליונה של השבר מסיסים. שמרו על התערובת תחת עצבנות מתמדת ב -24 עד 28 ° צ’ ב 150 x g עבור 48 h. מניחים את הבקבוקון מסנן המכיל את שברי הנפט הגולמי על משטח יציב ולחכות 10 עד 20 דקות כדי לאפשר הפרדה שבר מסיסים ובלתי מסיסים. העבר את ה-oWSF לבקבוקון סטרילי חדש, שמירת ה-Owsf על-ידי פתיחת הבקבוקון של המסנן התחתון והעברת השבר הנמס. באמצעות כל oWSF התאושש בשלב הקודם (~ 400 mL), להכין 1 L של BH אגר מינימום בינונית המכילה oWSF כמו מקור הפחמן היחיד. באמצעות oWIF שנותר בבקבוקון משלב 3.1.4, להכין 1 L של המדיום BH אגר מינימלי המכיל oWIF כמקור הפחמן היחיד. בידוד חיידקים של oWSF-ו-Owsf משפילים. באמצעות מים ואלמוגים מקדיר משלבים 1.1.2 ו 1.2.7, בהתאמה, לדלל את הדגימות עד 10-6 בתמיסה מלוחים סטרילית כפי שמתואר בשלב 2.1.1. פיפטה 100 μL של כל דילול על מנות פטרי המכילות BH-oWSF ו BH-Owsf אגר מדיה לוחית אותם. חזור על ההליכים המתוארים משלב 2.1.3 לשלב 2.1.5. 4. איחוד בחירת חברות לחלץ ולסדר את הדנ א. לזיהוי מיסים הפעל את מבודד מצויד בגליצרול כמתואר בשלב 2.3.1. חלץ את ה-DNA באמצעות ערכת החילוץ DNA (ראה טבלת חומרים). השימוש התחל 27f (5 ′-AGA GTT TGA TGA TGA CTC AG-3 ′) ו 1492r (5 ′-GTT TAC CTT משחק T-3 ′) עבור הגברה של הגן של 16 s rRNA. לבצע 50 μL ה-PCR תגובות לפי הפרוטוקול הבא: 5 μL של מאגר 10x פולימראז, 2 מ”מ MgCl2, 0.2 Mm dNTPs, 5 מ”מ של כל פריימר, 10 NG של דנ א גנומית, ו 2.5 U של taq dna פולימראז. הוסף פקדים שליליים (כלומר, עקירת DNA ריק ותגובות PCR ללא DNA תבנית) כדי להבטיח כי אין זיהום. הגדר את שלבי האופניים התרמיים הבאים: מחזור הדנטורציה הראשון ב-94 ° צ’ למשך 4 דקות; 35 מחזורים בשעה 94 ° c עבור 1 דקות, ואחריו 50 ° צ’ עבור 1 דקות, ו 72 ° c עבור 2.5 דקות; מחזור הארכה סופי עבור 10 דקות ב 72 ° c. בדוק אמפליקון יושרה ב 1.2% agarose ג’ל באמצעות 80 V. ג’ל מטהר את הדגימות בעזרת ערכת טיהור ג’ל (ראו טבלת חומרים). לכמת מוצרי PCR באמצעות פלואורומטר. שלח מוצר עבור רצף.הערה: לסיווגים מיונים טובים יותר, שיטת Sanger מומלצת60, משום שהיא מספקת רצפים ארוכים. התחל האוניברסלי 27f ו 1492r ניתן להשתמש כדי להגביר כמעט את כל אורך של 16 rRNA גן61. אם לא ניתן להרכיב contigs באמצעות זוג אחד של התחל, יש לשקול זוג נוסף באמצע הרצף. קבע את עקומת הגדילה. הפעל את הבודד מניות גליצרול משלב 2.2.5 כמתואר בשלב 2.3.1 אבל באמצעות 5 mL במקום 2 מ ל. הוסף 1% (v/v) של התרבות בוגרת 5 mL משלב 4.2.1 ב טריליטים, כדי בקבוקון 250 mL המכיל 100 mL של 3% LB מדיה. הקפד להכין מטריליטים של פקד שלילי (לא מתבצע) גם כן. הניחו את הצלוחיות בחממה תחת עצבנות מתמדת (150 x g) ב -24-28 ° c. לוקח 1 מ”ל מימן כל 4 h עבור 48 h. אם הזנים מציגים שיעור צמיחה גבוה, להקטין את 4 h מרווח. למדוד את צפיפות אופטית (OD) הערכה ב 600 ננומטר גל ו המושבה היוצרים יחידות (CFU) שנספר מ מדלל סדרתי מצופה על לוחות מדיה עשירים (100 μL צריך להיות מחוסן בכל צלחת מנורמל לנפח של 1 mL). מגרש את העקומות OD ו CFU ולנתח את הקורלציה של OD/CFU של כל זן בודד. מעתה והלאה, חשב את מספר התאים בהתבסס על ערכי ה-OD. לבצע מבחן האנטוניזם. הפעל את הבודד כמתואר בשלב 2.3.1. האיחסן מאמץ אחד בכל פעם לאורך באמצע צלחות המכילות את התקשורת אגר ואת האחרים בניצב למרכז. חזרו על כך עד שכל החיידקים שנבחרו נבדקים נגד כל האחרים. מודדאת הצלחות ב -24 עד 28 ° צ’ ומפקחים עליהם מדי יום על מנת לצפות בהילות פוטנציאליות המצביעות על פעילות עוינת. אם הילות הם נצפו המציין פעילות עוינת בין שני זנים, אחד מהם צריך להיות נשלל. בצע הרכבת קונסורציום. הפעל את הבודד כמתואר בשלב 2.3.1. גלולה את התאים ב 3,500 x g בעדינות לשטוף אותם 2x בנפח שווה של פתרון מלוחים. השהה את התאים בנפח שווה (כלומר, אם אמצעי האחסון הסופי היה 2 מ ל של תאים, שטוף אותם באמצעות 2 מ ל של תמיסה מלוחים והשהה אותם מחדש בנפח סופי של 2 מ”ל). איחסן 1 מ”ל תרבות ב 100 mL 3% מדיום ליברות ו דגירה ב 150 x g. חזור על השלב 4.5.2, החיסון 100 mL גדל, שטף, ו מושעה מחדש בתרבויות 10 L. מודטה ב מתיחת אוויר סטרילית, מקבל אוויר מסוננים ממשאבה. אם יש צורך ביותר תרבות, תמיד מחסן 1% של התרבות הגדולה בתקשורת טרייה. צנטריפוגה תרבויות ב 8,000 x g עבור 8 דקות ב 4 ° c. . להיפטר מסופרנטנט אחרי צנטריפוגה רוחצים את הגלולה, מחדש בעדינות את התאים ב 500 mL של תמיסת מלח סטרילי. חזור על שלבים ה4.5.5 וה4.5.6. השהה מחדש כל תרבות בודדת 100 mL של פתרון מלוחים ולמדוד את OD כדי להעריך את מספר התאים. חשב את עוצמת הקול של כל תרבות הנחוצה כדי להגיע לריכוז הסופי של 107 תאים mL-1. בצע ספירת CFU על מדיה עשירה לקבלת אישור סופי של הכדאיות והריכוז של התא. מערבבים כמות שווה של כל תרבות בודדת בצלוחיות סטרילי, סדרת מחלקים the consortium לתוך 50 mL סטרילי צינורות. המשיכו בארבע מעלות צלזיוס עד לחיסון.הערה: הכן את הרכבת קונסורציום טרי ככל האפשר כדי להבטיח לתאים עדיין יהיה בר קיימא. לחילופין, ספירת CFU ניתן לבצע לפני החיסון. כדי להרכיב קונסורציום אידיאלי, יש צורך להשתמש בבודד הצגת קיבולות מטבולית שונים ומשלימים. בדרך כלל, 6-10 מבודד משמשים ליצירת קונסורציומים, אבל מספר זה ישתנה בהתאם למאפיינים ולמטרות של החברים. 5. איתור מאפיינים מועילים לאלמוגים הפעל את מבודד ממניות גליצרול על ידי מבטל אותם על לוחות LB אגר ו מודפות אותם ב 24 למעלה 28 ° c על כדי להיות מושבות יחיד גדל. לבחור מושבה אחת מן הצלחות לחסן אותו 2 מ ל של מדיום ליברות סטרילי. מניחים את הצינור המכיל LB בינוני בעצבנות מתמדת (150 x g) ב -24-28 מעלות צלזיוס. בצע חילוץ DNA כמתואר בסעיף 4.1 לאיתור גנים העשויים להועיל על ידי ה-PCR.הערה: תנאי התגובה המולקולארית והתחל יהיו תלויים בגנים המיועדים. מתודולוגיות לבדיקת מאפייני BMC של זנים בודדים וזיהוי PCR עבור גנים שעלולים להועיל מתוארים בטבלה 1.

Representative Results

בהתאם לשיטות המתוארות כאן, ניתן היה לבודד מיקרואורגניזמים ממקורות מים שונים ולנובינים אלמוגים המציגים מאפייני BMC ומסוגלים לפגוע בכיתות שונות של מזהמים (איור 1). שימוש בדגימות מים שנאספו במפעל טיהור שפכים, המתקבלים CESA-UFRJ (ניסיוני המרכז לתברואה סביבתי של האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז’ניירו), ועל בסיס ההליך המוצג כאן, 33 זנים חיידקיים מסוגל לבזות EE2 at ריכוז סופי של 5mg/L היו מבודדים (איור 2א). בנוסף, באמצעות הטכניקה לבחירת חיידקים משפילים שמן, 20 זנים המסוגלים לבזות הן owsf (איור 2ב) ו owsf (איור 2ג) היו מבודדים. מאפייני BMC הוקרן במיקרואורגניזמים מבודדים ממינים אלמוגים שונים בתנאים מגוונים. ביניהם, זן המציג פעילות עוינת חזקה נגד הפתוגן האלמוג Vibrio coralliilyticus איור 3a), זנים המסוגלים לבזות אוריאה (איור 3ב), מפיק קטלאז טוב (איור 3 C), ומיקרואורגניזמים המציגים גנים שעלולים להועיל (איור 3D) נמצאו. העסקת שתי גישות בשילוב (כלומר, בוררות והחיסון BMC), ניתן היה להגן על אלמוגים מפני השפעות חשיפה לנפט. בשביל זה, הנפט הקונסורציום הביומגשר pBMC, מבודד האלמוגים Mussismilia הארטטיי, חוסנו על נובינים אלמוגים שנחשפו 1% שמן בטריליטים21. הטיפולים שנחשפו לשמן הציגו ירידה מתקדמת ב-Fv/Fm מהיום הרביעי ואילך, והגיעו לערכים הקרובים לאפס ביום העשירי. פלואורסצנטית משתנה/פלואורסצנטית מקסימלי (Fv/Fm) סיפק מידה של היעילות המירבית של פוטוסיסטם II (פסיב) של הזואוקספיליות, המייצגת מדידה עקיפה של בריאות האלמוגים. מצד שני, נובינים האלמוגים הנוכחים באקווריום שחוסנו עם הקונסורציום הראו יכולת פוטוכימית משומרת טוב יותר (איור 4). איור 1: סיכום השלבים העיקריים של בחירה והרכבה של הקונסורציום ביוריאמגשר-pBMC. הערכה של שלבי בחירת מזהמים משפילים (באפור) והשלבים הסופיים המשמשים לבחירת הקונסורציום (רצפי דנ א, עקומת הצמיחה, בדיקת האנטוניזם, ו קונסורציום הרכבת באדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: מבחר של חיידקים משפילים מזהמים. (א) חיידקי מבודדגדל על לוחיות המדיה המינימליות המכילה EE2 כמקור הפחמן היחיד. (ב) חיידקים המושבות גדל על לוחיות המדיה המינימליות המכילים owsf כמקור הפחמן היחיד. (ג) בקטריה מושבות הגדלות על לוחיות המדיה המינימליות המכילות את owif כמקור הפחמן היחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: זיהוי מאפייני pBMC. (א) כתמים בטריליטים של הזנים המציגים פעילות עוינת נגד הפתוגן האלמוג vibrio coralliilyticus (בשחור) ואת זן שליטה (בירוק). (ב) זנים הגדלים על מדיה המכילה אוריאה כמקור הפחמן היחיד. (ג) מאמץ הפקת קטלאז (+) ומזן גרוע של מפיק קטלאז (-). (ד) דוגמה לזיהוי ה-PCR של הגן הנקיי (ליין 1 = הסולם 1kb; ליין 2 = בקרת דנ א ריק שלילי; ליין 3 = נירנברג הזיהוי; ליין 4 = PCR תגובות ללא תבנית DNA של תבניות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: מדידות Fv/Fm של מ. הרטטיי נובינים מותאמים בשעה 17:00, תוך שימוש בכלורופיל פלואורומטר מצלילה-פם. Fv/Fm מדידות של הקונסורציום בקרת טיפולים, שמן, ושמן עם קונסורציום בוצעו בטריליטים כל יום במשך 10 ימים. סטיית התקן מוצגת. תכונות של הגרף שונו עם אישור מהתוצאות הקודמות21, זמין ב Https://www.nature.com/articles/srep18268 תחת ייחוס מלאי רישיון 4.0. . מונחים מלאים ב-http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. מואה יקרואורגניזם טכניקת גילוי פניות תקנות אקלים; טיולי אפניים; תרכובות מיקרוביאלית; להגדיל את הגנת נוגדי חמצון של תאים. אספרגיליוס סידושני PCR עבור גן dddP 81 פסבדו-P12 בינונית תרבותית עם DMSP 82 פסבדו-מערכות PCR עבור גן dmdA 33 . התקנה ביולוגית של פתוגנים מיקרובידום מאקרופורה אזור ברור של עיכוב 83 תמציות מאלמוגים שיטת עיכוב גדילה 84 מריקובקטר sp. שורצים אומר 85 פסבדו-מערכות צלחת אגר חוצה פסים 86 פסבדו-מערכות שיטת אגר-דיפוזיה 33 הטבה לתהליך הסתיידות; מקור החנקן לאלמוגים בעלי-לובן. . זואוקסנטלות שיטת צביעה 87 מיקרוביבאום מסטילואורה פיטיללאטה ___ 88 מיקרוביזום מאקרופורה שיטה מאת בוללנד ואח ‘ 80 89 מחזור חנקן; להגדיל את קיבוע החנקן. קהילת מיקרוביאלית טרינריה 90 קהילת מיקרוביאלית PCR 91 קהילת מיקרוביאלית טרינריה 92 קהילת מיקרוביאלית הפחתת שיטת אצטילן (C2H2) 93 פסאודו-מונמונס sp והלאומונס טאאנאנסיס PCR 33 מחזור חנקן; ירידה בריכוז האמוניום. פסבדו-מערכות PCR 33 מיקרובידום מטובסטראאה coccinea PCR 94 מיקרוביפה מהאסטאוקסגיה מצויה ניתוח מתכת חזוי 95 הולובימונט הגנה מפני מינים של חמצן תגובתי (ROS). פסבדו-על, מרינה קובטיה והלאומונס טאאנאנסיס מבחן קטלאז 33 . זואוקסנטלות אמפיקס אדום 96 . ויבריו פלגיוס וסנכרון-צ’קוקס חזרת peroxidase-שיטת הסקוטין 97 ויברו פישרי שיטות מרובות 98 טבלה 1: איתור מאפייני BMC, מנגנון פעולה (מואה), מיקרואורגניזמים דיווחו המציגים את הפוטנציאל ואת הטכניקה המשמשים כדי לזהות את המאפיין.

Discussion

בשנים האחרונות ה50. למשל, מעל 200 חיידקים בקרב חיידקים, כחוליות, מיקרואצות, ופטריות בבתי גידול שונים מספר, נקבעו כפי שניתן לציין נוכחות ו/או לבזות שמן פחמימנים62,63,64 . בנוסף, מחלקות אחרות של תרכובות הגורמות להשפעות על הסביבה ועל בני אדם, כגון פלסטיק, ביספנול A, משבלי האנדוקרינית, ומתכות כבדות, הם מטרות עבור פיתוח טכניקת bioremediation65,66, 67. מצד שני, התפתחות ימית פרוביוטיקה הוגבלה לשדות כי יש השפעה ברורה על הכלכלה, כגון פרוביוטיקה דגים בחקלאות ימית68,69. עם זאת, בידוד ואפיון של מיקרואורגניזמים מועילים להגנה על שוניות אלמוגים, מערכות אקולוגיות ימיות התומכות בדיג, בתיירות ובפעילויות רווחיות אחרות, מתחילות להיות מוערכת ב-15. כאן, הפרוטוקול זול, קל ונגיש כדי לבחור מיקרואורגניזמים משפילה-משפיל שיכולים גם להציג מאפיינים העלולים להועיל לאקולוגיות ימיים מקומיים, במיוחד מיקרואורגניזמים מועילים לאלמוגים (pBMCs), הוא מתואר.

בנוסף, השיטה הוכיחה כאן היא ישימה מאוד למספר תרכובות וסוגים שונים של מקורות מיקרוביאלית. ניתן למקד את מזהמים שונים על ידי החלפת מקור הפחמן היחיד שנוסף למדיה המינימלית. בשביל זה, במקום נפט או EE2, יש להוסיף תרכובות אחרות בריכוז הרצוי. זה יהיה הלחץ הסלקטיבי לבודד. את degraders למזהמים ממוקדים למשל, מיקרואורגניזמים מסוגלים לפגוע מחלקות אחרות של משתמשים האנדוקרינים כבר נבחרו ונבדקו באמצעות אותה מתודולוגיה70. יתר על כן, אורגניזמים ימיים וארציים אחרים, כגון ספוגים וצמחים71,72, כמו גם סוגים שונים של דגימות סביבתיות, כגון קרקע, דלק, וסלעים יכול לשמש מקורות משפיל מוחיים25, 73,74. למשל, ניתן היה לזהות ולבודד חיידקים משפילים פחמימנים מקרקע שונים ומשקעים דגימות25,54,63,64,75. לבסוף, ביצוע שינויים קלים בתקשורת, מיקרואורגניזמים אחרים מאשר חיידקים ניתן לבחור בקלות כמו חיידקים משפילים. למשל, זן מיקרואצות עם היכולת לבזות ביעילות תרכובות אסטרוגן דווחה76.

באופן אידיאלי, bioremediation-פרוביוטיקה קונסורציומים חייב להיות מורכב עבור כל מתחם ספציפי או אזור. מיקרובים הגדלים בסביבה מסוימת עלולים לא לצמוח גם באתרים חדשים בהשוואה למצבם הטבעי. מכיוון שחוקרים לא מצאו מוצר שיכול להיות מיושם ביעילות תחת כל התנאים הסביבתיים השונים, הרכבה קונסורציומים חדש צריך להתבצע עבור כל מצב ספציפי. זה יהיה דומה לרפואה אישית עבור התאוששות מותאמת לסביבה. מסיבה זו, הקמת בנק מרכזי של זנים מיקרוביאלית עם מאפיינים פרוביוטיקה פוטנציאליים ויכולת השפלה מהווה צעד מכריע בהתקדמות התחום. יוזמה זו תחסוך את הזמן והעבודה, תורמת להרכבה של קונסורציומים ספציפית חדשה ברחבי העולם.

מיקרואורגניזמים הקשורים אלמוגים (כלומר, מיקרואצות, חיידקים, הארכאונים, פטריות, ווירוסים) יש תפקיד מורכב מורכב בשמירה על הומאוסטזיס מארח19. הגורמים הסביבתיים, כגון זיהום, יכולים גם לערער את היציבות של מיקרובידום האלמוגים, וכתוצאה מכך חוסר ביוביוזיס, העלול לגרום למחלות ולתמותה30. המנגנונים שבהם האלמוג עשוי לתמוך בבריאות האלמוגים מתחילים להתגלות. מנגנונים אלה הם המפתח להבנת עמידות האלמוגים והחוסן לגורמי הסביבה, וכתוצאה מכך לקדם את ההתמדה והשימור של השונית. בנוסף, ממצאים בתחום יסייעו להבין את האינטראקציות הכלליות-microbiome, אשר עשוי לתרום לפיתוח של פרוביוטיקה טוב יותר וקידום אסטרטגיות בריאות בתחומים אחרים. חשוב גם לחקור טוב יותר כיצד מוצרי פרוביוטיקה אלה יכולים להפריע לבריאות המטאורגניזם במהלך אירועי הלחץ. למשל, עבודה מראה כי הגדלת ביצועי האלמוגים נובע פרוביוטיקה ולא פשוט האלמוג באמצעות חיידקים כמו מקור מזון עדיין יש צורך.

במקביל, פיתוח גישות המסירה הקונסורציומים החדשות והשיפור של הקיימים הינם בעלי חשיבות רבה. שיטות אלטרנטיביות לקונסורציום, כמו גם גישות חדשניות, כגון השימוש במזון אלמוג (כלומר, ארטמיה ורוטידון) ושימוש בהם כווקטורים, מבטיחים. מערכות משלוח אלה יכולים גם להיות שונה כדי היעד אורגניזמים ימיים אחרים יהיה חיוני להצלחה של שדה פרוביוטיקה ימית.

הפחתת זיהום והתמדה בשונית האלמוגים הינם כיום שניים מהנושאים העיקריים המסומנים בכנסים סביבתיים באופן סדיר. סדר היום 2030, מסמך שפורסם על-ידי האומות המאוחדות המתאר את החברה העולמית למטרות כלליות, צריך להגיע לעתיד בר-קיימא, ומקדיש מטרות ספציפיות לכל סוגיה. בעוד מטרה 6 מדגיש את החשיבות של שיפור איכות המים על ידי הפחתת זיהום, המטרה 14 מחזקת את הרלוונטיות של שימור ושימוש בר קיימא של אוקיינוסים, ימים, ומשאבים ימיים77. בהקשר זה, שימור שונית האלמוגים תלוי בשינויים האמורים להיות מושגת בעתיד הקרוב, כולל הפחתת זיהום. זה חשוב מאוד, כי רוב הפסדים אלמוגים מסיבית התרחשה כאשר גורמים אחרים נוספו לאירועי האקלים, כגון הרס הגידול המקומי זיהום78,79. נייר זה הראה כי ניתן לשלב גישור ובקרה של pBMC החיסון לבזות מזהמים ספציפיים, בעוד הוא עשוי להגביר את ההתנגדות של האלמוגים וחוסן להתמודד עם מזהמים וסוגיות אחרות. אופטימיזציה של פרוטוקולים קיימים ו/או פיתוח שיטות חדשניות, משולב או מיושם באופן עצמאי, יהיה חיוני כדי לקבוע את עתידה של האקולוגית הימית.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נעשה בשיתוף עם הפרויקט R & D מתמשך רשום כ anp 21005-4, “probio-עמוק-סקר של השפעות פוטנציאליות הנגרמת על ידי חיפושי נפט וגז על הולויונים ימיים ים עמוקים ומבחר של ביולוגי פוטנציאלי ו bioremediation תהליכים עבור מערכות אקולוגיות אלה “(UFRJ/פגז ברזיל/ANP) –” PROBIO-דיפ-Levantamento באמצעות הולוביטוס מריניונים במאריבאס בעומק הראש וההאבלהבליחהבליגההביוקיהעל מעבד e ביורופי מעריץ של מעטפת “בחסות” של פגז ברזיל תחת ה-ANP R & D לוי בתור “Com, de Investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento. המחברים גם להודות Conselho הלאומי דה Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) ו-Coordençde מפואר ביותר בשביל התמיכה הפיננסית, ו קמילה מסייאס, פיליפ Rosado, ו הנריק Fragoso dos סנטוס, עבור התמונות שסופקו.

Materials

500 mL PYREX Media Storage Bottle thomas scientific/Corning 1743E20/1395-500 Used to sample water.
500 mL Aspirator Bottles thomas scientific/Corning 1234B28/1220-2X Used to separate the oil fractions.
6-inch wire cutter plier thomas scientific/Restek 1173Y64/23033 Used to cut coral fragments.
17a-Ethinylestradiol LGC Standards DRE-C13245100 Used as the only carbon source to make the selective media.
Agar Himedia PCT0901-1KG Used to make solid media.
Bushnell Haas Broth Himedia M350-500G Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.
Erlenmeyer Flask thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble) 4882H35/26500-125 Used to incubate coral macerate with glass beads.
GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit GE Healthcare 28903470 Used to purify PCR products before sending them for sequencing.
Glass Beads MP Biomedicals 1177Q81/07DP1070 Used to detach the microorganisms from coral structures.
Laminar Flow Hood Needed to work at sterile conditions.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth) Himedia M1245-1KG Used as rich media to grow bacteria.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar) Himedia M384-500G Used as rich media to grow bacteria.
Orbital-Shaker Incubator Used to incubate liquid media and oil.
Plates Incubator Used to incubate plates.
Porcelain Mortar and Pestle Thomas scientific/United Scientific Supplies 1201U69/JMD150 Used to macerate coral fragments.
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.
Refrigerated Centrifuge Used to centrifuge bacterial cultures.
Spectrophotometer Used to measure optical density of bacterial cultures.
Wizard Genomic DNA Purification kit Promega A1120 Used for microbial strains DNA extraction.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durand, M., Grattan, J. Effects of volcanic air pollution on health. Lancet. 357, 164 (2001).
  2. Ramaswami, A., Russell, A. G., Culligan, P. J., Sharma, K. R., Kumar, E. Meta-principles for developing smart, sustainable, and healthy cities. Science. 352, 940-943 (2016).
  3. Dökmeci, A. H., Yildiz, T., Ongen, A., Sivri, N. Heavy metal concentration in deepwater rose shrimp species (Parapenaeus longirostris, Lucas, 1846) collected from the Marmara Sea Coast in Tekirdağ. Environmental Monitoring and Assessment. 186, 2449-2454 (2014).
  4. Skaare, J. U., et al. Ecological risk assessment of persistent organic pollutants in the arctic. Toxicology. 181-182, 193-197 (2002).
  5. Garstang, W. The impoverishment of the sea. A critical summary of the experimental and statistical evidence bearing upon the alleged depletion of the trawling grounds. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 6, 1-69 (1900).
  6. Korajkic, A., Brownell, M. J., Harwood, V. J. Investigation of human sewage pollution and pathogen analysis at Florida Gulf coast beaches. Journal of Applied Microbiology. 110, 174-183 (2011).
  7. Liu, J., Yang, W. Water sustainability for China and beyond. Science. 337, 649-650 (2012).
  8. Eriksen, M., et al. Plastic pollution in the world’s oceans: more than 5 trillion plastic pieces weighing over 250,000 tons afloat at sea. PLoS One. 9, 111913 (2014).
  9. Vilela, C. L. S., Bassin, J. P., Peixoto, R. S. Water contamination by endocrine disruptors: Impacts, microbiological aspects and trends for environmental protection. Environmental Pollution. 235, 546-559 (2018).
  10. Ueno, D., et al. Global pollution monitoring of PCBs and organochlorine pesticides using skipjack tuna as a bioindicator. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45, 378-389 (2003).
  11. Villela, H. D. M., Peixoto, R. S., Soriano, A. U., do Carmo, F. L. Microbial bioremediation of oil contaminated seawater: A survey of patent deposits and the characterization of the top genera applied. Science of the Total Environment. 666, 743-758 (2019).
  12. Rabalais, N. N., et al. Eutrophication-driven deoxygenation in the coastal ocean. Oceanography. 27, 172-183 (2014).
  13. Calmet, D. P. Ocean disposal of radioactive waste. Status report. IAEA Bulletin. 31, 47-50 (1989).
  14. Swart, P. K. Coral Reefs: Canaries of the Sea, Rainforests of the oceans. Nature Education Knowledge. 4, 5 (2013).
  15. National Academies of Sciences and Medicine, E. . A Research Review of Interventions to Increase the Persistence and Resilience of Coral Reefs. , (2019).
  16. Béné, C., et al. Feeding 9 billion by 2050-Putting fish back on the menu. Food Security. 7, 261-274 (2015).
  17. Hughes, T. P., et al. Global warming and recurrent mass bleaching of corals. Nature. 543, 373 (2017).
  18. Hughes, T. P., et al. Spatial and temporal patterns of mass bleaching of corals in the Anthropocene. Science. 359, 80-83 (2018).
  19. Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., Zilber-Rosenberg, I. The role of microorganisms in coral health, disease and evolution. Nature Reviews Microbiology. 5, 355 (2007).
  20. Shaver, E. C., Burkepile, D. E., Silliman, B. R. Local management actions can increase coral resilience to thermally-induced bleaching. Nature Ecology & Evolution. 2, 1075-1079 (2018).
  21. Santos, H., et al. Impact of oil spills on coral reefs can be reduced by bioremediation using probiotic microbiota. Scientific Reports. 5, 18268 (2015).
  22. Whitman, W. B. Bacteria and the fate of estrogen in the environment. Cell Chemical Biology. 24, 652-653 (2017).
  23. DeLeo, D. M., Ruiz-Ramos, D. V., Baums, I. B., Cordes, E. E. Response of deep-water corals to oil and chemical dispersant exposure. Deep-Sea Research. Part II Topical Studies in oceanography. 129, 129-147 (2016).
  24. Zinicovscaia, I., Cepoi, L. . Cyanobacteria for bioremediation of wastewaters. , (2016).
  25. Cury, J. C., et al. Microbial diversity and hydrocarbon depletion in low and high diesel-polluted soil samples from Keller Peninsula, South Shetland Islands. Antarctic Science. 27, 263-273 (2015).
  26. Sinha, R. K., Valani, D., Sinha, S., Singh, S., Herat, S. Bioremediation of contaminated sites: a low-cost nature’s biotechnology for environmental clean up by versatile microbes, plants, earthworms. Solid Waste Management and Environmental Remediation. , 971-978 (2009).
  27. Maila, M. P., Cloete, T. E. Bioremediation of petroleum hydrocarbons through landfarming: Are simplicity and cost-effectiveness the only advantages. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 3, 349-360 (2004).
  28. Madsen, K., et al. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology. 121, 580-591 (2001).
  29. Saleem, M., Arshad, M., Hussain, S., Bhatti, A. S. Perspective of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) containing ACC deaminase in stress agriculture. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 34, 635-648 (2007).
  30. Sweet, M. J., Bulling, M. T. On the importance of the microbiome and pathobiome in coral health and disease. Frontiers in Marine Science. 4, 9 (2017).
  31. Reshef, L., Koren, O., Loya, Y., Zilber-Rosenberg, I., Rosenberg, E. The coral probiotic hypothesis. Environmental Microbiology. 8, 2068-2073 (2006).
  32. Peixoto, R., Rosado, P. M., Leite, D. C. d. e. A., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial Microorganisms for Corals (BMC): Proposed Mechanisms for Coral Health and Resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
  33. Rosado, P., et al. Marine probiotics: increasing coral resistance to bleaching through microbiome manipulation. The The ISME Journal. 13, 921-936 (2019).
  34. Heberer, T., Reddersen, K., Mechlinski, A. From municipal sewage to drinking water: fate and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment in urban areas. Water Science and Technology. 46, 81-88 (2002).
  35. Barel-Cohen, K., et al. Monitoring of natural and synthetic hormones in a polluted river. Journal of Environmental Management. 78, 16-23 (2006).
  36. Balest, L., Mascolo, G., Di Iaconi, C., Lopez, A. Removal of endocrine disrupter compounds from municipal wastewater by an innovative biological technology. Water Science and Technology. 58, 953-956 (2008).
  37. Liu, Z., Kanjo, Y., Mizutani, S. A review of phytoestrogens: Their occurrence and fate in the environment. Water Research. 44, 567-577 (2010).
  38. Chapman, H. F., et al. A national approach to health risk assessment, risk communication and management of chemical hazards from recycled water. Waterlines. 48, (2011).
  39. Rocha, M. J., Cruzeiro, C., Ferreira, C., Rocha, E. occurrence of endocrine disruptor compounds in the estuary of the Iberian Douro River and nearby Porto Coast (NW Portugal). Toxicological and Environmental Chemistry. 94, 252-261 (2012).
  40. Nie, M., et al. Environmental estrogens in a drinking water reservoir area in Shanghai: occurrence, colloidal contribution and risk assessment. Science of the Total Environment. 487, 785-791 (2014).
  41. Ribeiro, C., Ribeiro, A. R., Tiritan, M. E. Priority substances and emerging organic pollutants in Portuguese aquatic environment: a review. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 238, 1-44 (2016).
  42. Wu, C., Huang, X., Lin, J., Liu, J. Occurrence and fate of selected endocrine-disrupting chemicals in water and sediment from an urban lake. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 68, 225-236 (2015).
  43. Shi, W., Wang, L., Rousseau, D. P. L., Lens, P. N. L. Removal of estrone, 17α-ethinylestradiol, and 17ß-estradiol in algae and duckweed-based wastewater treatment systems. Environmental Science and Pollution Research. 17, 824-833 (2010).
  44. Ternes, T., Bonerz, M., Schmidt, T. Determination of neutral pharmaceuticals in wastewater and rivers by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 938, 175-185 (2001).
  45. Ternes, T. A., Andersen, H., Gilberg, D., Bonerz, M. Determination of estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS. Analytical Chemistry. 74, 3498-3504 (2002).
  46. Tarrant, A. M., Atkinson, M. J., Atkinson, S. Effects of steroidal estrogens on coral growth and reproduction. Marine Ecology Progress Series. 269, 121-129 (2004).
  47. Atkinson, S., Atkinson, M. J., Tarrant, A. M. Estrogens from sewage in coastal marine environments. Environmental Health Perspectives. 111, 531-535 (2003).
  48. Schoenmakers, H. J. N., Van Bohemen, C. G., Dieleman, S. J. Effects of Oestradiol-17 β on the Ovaries of the Starfish Asterias rubens. Development Growth and Differentiation. 23, 125-135 (1981).
  49. Sarojini, R., Jayalakshmi, K., Sambashivarao, S. Effect of external steroids on ovarian development in freshwater prawn, Macrobrachium lamerrii. Journal of Advanced Zoology. 7, 50 (1986).
  50. Hathaway, R. R., Black, R. E. Interconversions of estrogens and related developmental effects in sand dollar eggs. General and Comparative Endocrinology. 12, 1-11 (1969).
  51. Ghosh, D., Ray, A. K. Subcellular action of estradiol-17β in a freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. General and Comparative Endocrinology. 90, 274-281 (1993).
  52. Aris, A. Z., Shamsuddin, A. S., Praveena, S. M. occurrence of 17α-ethynylestradiol (EE2) in the environment and effect on exposed biota: a review. Environment International. 69, 104-119 (2014).
  53. International Energy Agency. . Key World Energy Statistics (KWES). , (2018).
  54. Carmo, F. L., et al. Bacterial structure and characterization of plant growth promoting and oil degrading bacteria from the rhizospheres of mangrove plants. Journal of Microbiology. 49, 535-543 (2011).
  55. Piatt, J. F., Lensink, C. J., Butler, W., Kendziorek, M., Nysewander, D. R. Immediate impact of the’Exxon Valdez’oil spill on marine birds. The Auk. 107 (2), 387-397 (1990).
  56. White, H. K., et al. Impact of the Deepwater Horizon oil spill on a deep-water coral community in the Gulf of Mexico. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20303-20308 (2012).
  57. Abdel-Shafy, H. I., Mansour, M. S. M. A review on polycyclic aromatic hydrocarbons: source, environmental impact, effect on human health and remediation. Egyptian Journal of Petroleum. 25, 107-123 (2016).
  58. Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Water contamination reduces the tolerance of coral larvae to thermal stress. PLoS One. 6, 19703 (2011).
  59. Brown, E. J., Resnick, S. M., Rebstock, C., Luong, H. V., Lindstrom, J. UAF radiorespirometric protocol for assessing hydrocarbon mineralization potential in environmental samples. Biodegradation. 2, 121-127 (1991).
  60. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  61. Vergin, K. L., et al. Screening of a Fosmid Library of Marine Environmental Genomic DNA Fragments Reveals Four Clones Related to Members of the Order Planctomycetales. Applied and Environmental Microbiology. 64 (8), 3075-3078 (1998).
  62. Yakimov, M. M., Timmis, K. N., Golyshin, P. N. Obligate oil-degrading marine bacteria. Current Opinion in Biotechnology. 18, 257-266 (2007).
  63. Santos, H. F., Cury, J. C., Carmo, F. L., Rosado, A. S., Peixoto, R. S. 18S rDNA sequences from microeukaryotes reveal oil indicators in mangrove sediment. PLoS One. 5, 12437 (2010).
  64. Jurelevicius, D., Cotta, S. R., Peixoto, R., Rosado, A. S., Seldin, L. Distribution of alkane-degrading bacterial communities in soils from King George Island, Maritime Antarctic. European Journal of Soil Biology. 51, 37-44 (2012).
  65. Paço, A., et al. Biodegradation of polyethylene microplastics by the marine fungus Zalerion maritimum. Science of the Total Environment. 586, 10-15 (2017).
  66. Zhang, W., Yin, K., Chen, L. Bacteria-mediated bisphenol A degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97, 5681-5689 (2013).
  67. Gadd, G. M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiology. 156, 609-643 (2010).
  68. Balcázar, J. L., et al. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology. 114, 173-186 (2006).
  69. Gatesoupe, F. J. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture. 180, 147-165 (1999).
  70. Ren, Y. X., Nakano, K., Nomura, M., Chiba, N., Nishimura, O. Effects of bacterial activity on estrogen removal in nitrifying activated sludge. Water Research. 41, 3089-3096 (2007).
  71. Santos-Gandelman, J. F., Giambiagi-deMarval, M., Muricy, G., Barkay, T., Laport, M. S. Mercury and methylmercury detoxification potential by sponge-associated bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 106, 585-590 (2014).
  72. Yamaga, F., Washio, K., Morikawa, M. Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 isolated from the rhizosphere of duckweed Lemna aoukikusa. Environmental Science & Technology. 44, 6470-6474 (2010).
  73. Soriano, A. U., et al. Microbiological aspects of biodiesel and biodiesel/diesel blends biodeterioration. International Biodeterioration & Biodegradation. 99, 102-114 (2015).
  74. Da Cunha, C. D., Rosado, A. S., Sebastián, G. V., Seldin, L., Von der Weid, I. Oil biodegradation by Bacillus strains isolated from the rock of an oil reservoir located in a deep-water production basin in Brazil. Applied Microbiology and Biotechnology. 73, 949-959 (2006).
  75. Prantera, M. T., Drozdowicz, A., Leite, S. G., Rosado, A. S. Degradation of gasoline aromatic hydrocarbons by two N 2-fixing soil bacteria. Biotechnology Letters. 24, 85-89 (2002).
  76. Lai, K. M., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Biotransformation and bioconcentration of steroid estrogens by Chlorella vulgaris. Applied and Environmental Microbiology. 68, 859-864 (2002).
  77. United Nations. . Transforming our World: The 2030 Agenda for Sustainable Development. , (2015).
  78. Bellwood, D. R., Hughes, T. P., Folke, C., Nyström, M. Confronting the coral reef crisis. Nature. 429, 827 (2004).
  79. Pandolfi, J. M., et al. Global trajectories of the long-term decline of coral reef ecosystems. Science. 301, 955-958 (2003).
  80. Bolland, E. G., Cook, A. R., Turner, N. A. Urea as a sole source of nitrogen for plant growth. I. The development of urease activity in Spirodela oligorrhiza. Planta. 83, 1-12 (1968).
  81. Kirkwood, M., Todd, J. D., Rypien, K. L., Johnston, A. W. B. The opportunistic coral pathogen Aspergillus sydowii contains dddP and makes dimethyl sulfide from dimethylsulfoniopropionate. The ISME Journal. 4, 147-150 (2010).
  82. Raina, J., Tapiolas, D., Motti, C., Foret, S., Seemann, T. Isolation of an antimicrobial compound produced by bacteria associated with reef-building corals. Peer J. 4, 2275 (2016).
  83. Ritchie, K. B. Regulation of microbial populations by coral surface mucus and mucus-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 322, 1-14 (2006).
  84. Gochfeld, D. J., Aeby, G. S. Antibacterial chemical defenses in Hawaiian corals provide possible protection from disease. Marine Ecology Progress Series. 362, 119-128 (2008).
  85. Alagely, A., Krediet, C. J., Ritchie, K. B., Teplitski, M. Signaling mediated cross-talk modulates swarming and biofilm formation in a coral pathogen Serratia marcescens. The ISME Journal. 5, 1609-1620 (2011).
  86. Kvennefors, E. C. E., et al. Regulation of bacterial communities through antimicrobial activity by the coral holobiont. Microbial Ecology. 63, 605-618 (2012).
  87. Biscere, T., et al. Enhancement of coral calcification via the interplay of nickel and urease. Aquatic Toxicology. 200, 247-256 (2018).
  88. Grover, R., Maguer, J., Allemand, D., Ferrier-Pages, C. Urea uptake by the scleractinian coral Stylophora pistillata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 332, 216-225 (2006).
  89. Crossland, C. J., Barnes, D. J. The Role of Metabolic Nitrogen in Coral Calcification. Marine Biology. 28, 325-332 (1974).
  90. Olson, N. D., Ainsworth, T. D., Gates, R. D., Takabayashi, M. Diazotrophic bacteria associated with Hawaiian Montipora corals: diversity and abundance in correlation with symbiotic dinoflagellates. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 371, 140-146 (2009).
  91. Lema, K. A., Willis, B. L., Bourneb, D. G. Corals form characteristic associations with symbiotic nitrogen-fixing bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 78, 3136-3144 (2012).
  92. Santos, H. F., et al. Climate change affects key nitrogen-fixing bacterial populations on coral reefs. The ISME Journal. 8, 2272-2279 (2014).
  93. Cardini, U., et al. Functional significance of dinitrogen fixation in sustaining coral productivity under oligotrophic conditions. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282, 20152257 (2015).
  94. Yang, S., Sun, W., Zhang, F., Li, Z. Phylogenetically diverse denitrifying and ammonia-oxidizing bacteria in corals Alcyonium gracillimum Tubastraea coccinea. Marine Biotechnology. 15, 540-551 (2013).
  95. de Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. M., Polonia, A. R. M., Gomes, N. C. M. Bacterial community composition and predicted functional ecology of sponges, sediment and seawater from the thousand islands reef complex, West Java, Indonesia. FEMS Microbiology Ecology. 91, (2015).
  96. Suggett, D. J., et al. Photosynthesis and production of hydrogen peroxide by Symbiodinium (Pyrrhophyta) phylotypes with different thermal tolerances. Journal of Phycology. 44, 948-956 (2008).
  97. Petasne, R. G., Zika, R. G. Hydrogen peroxide lifetimes in south Florida coastal and offshore waters. Marine Chemistry. 56, 215-225 (1997).
  98. McFall-Ngai, M. J. Consequences of evolving with bacterial symbionts: insights from the squid-Vibrio associations. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 30, 235-256 (1999).

Tags

BioremediationProbioticsMetaorganismCoral HealthPollution MitigationMicrobial StrainsIsolationScreeningBeneficial MicroorganismsContaminant DegradationConsortiumAntagonistic ActivityCoral PreservationSamplingCoral FragmentsMicrobiologySaline SolutionMacerationCulture Flask

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., Assis, J. M., Varona, N., Burke, C., Coil, D. A., Eisen, J. A., Peixoto, R. S. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60238, doi:10.3791/60238 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image