JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Prospectie van microbiële stammen voor bioremediatie en probiotica ontwikkeling voor Metaorganisme onderzoek en conservering

Published: October 31, 2019
doi:
10.3791/60238
, , , , , , ,
1LEMM, Laboratory of Molecular Microbial Ecology, Institute of Microbiology Paulo de Góes,Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2Genome Center,University of California, Davis, 3IMAM-AquaRio – Rio de Janeiro Aquarium Research Center

Summary

Vervuiling beïnvloedt alle biomes. Mariene omgevingen zijn vooral getroffen, vooral koraalriffen, een van de meest gevoelige ecosystemen op aarde. Bioremediation is de capaciteit van organismen om verontreinigingen te degraderen. Hier beschrijven we methodologieën te isoleren en te testen microben presenteren bioremediatie vermogen en potentiële probiotische kenmerken voor koralen.

Abstract

Vervuiling beïnvloedt alle biomes. Mariene omgevingen zijn vooral getroffen, vooral koraalriffen, een van de meest gevoelige ecosystemen op aarde. Wereldwijd zijn 4.500.000.000 mensen economisch afhankelijk van de zee, waar het grootste deel van hun levensonderhoud wordt geleverd door koraalriffen. Koralen zijn van groot belang en daarom leidt hun uitsterven tot catastrofale gevolgen. Er zijn verschillende mogelijke oplossingen voor het herstellen van mariene verontreinigende stoffen en lokale verontreiniging, met inbegrip van bioremediation. Bioremediation is de capaciteit van organismen om verontreinigingen te degraderen. De aanpak biedt verschillende voordelen, zoals duurzaamheid, relatief lage kosten en het feit dat deze kan worden toegepast in verschillende ecosystemen, waardoor minimale gevolgen voor het milieu ontstaan. Als een extra voordeel, de manipulatie van endogene microbiomes, met inbegrip van putatieve nuttige micro-organismen voor koralen (pBMCs), probiotische effecten voor zeedieren kunnen hebben. In deze context, het gebruik van de twee benaderingen, bioremediatie en PBMC inoculatie gecombineerd, kan veelbelovend zijn. Deze strategie zou de afbraak van specifieke verontreinigende stoffen die schadelijk kunnen zijn voor koralen en andere meta organismen bevorderen, terwijl ook de gastheer weerstand en veerkracht te verhogen om te gaan met vervuiling en andere bedreigingen. Deze methode richt zich op de selectie van pBMCs om twee verontreinigingen te degraderen: de synthetische oestrogeen 17a-ethinylestradiol (EE2) en ruwe olie. Beide zijn gemeld aan mariene dieren, met inbegrip van koralen, en mensen negatief beïnvloeden. Het protocol beschrijft hoe te isoleren en te testen bacteriën die in staat zijn om de specifieke verontreinigingen te vernederen, gevolgd door een beschrijving van hoe te detecteren sommige putterende gunstige kenmerken van deze geassocieerde microben aan hun koraal gastheer. De hier beschreven methodologieën zijn relatief goedkoop, gemakkelijk uit te voeren en zeer aanpasbaar. Bijna elke vorm van oplosbare doel stof kan worden gebruikt in plaats van EE2 en olie.

Introduction

Vervuiling is een belangrijke kwestie die de gezondheid van mensen, dieren en plantenwereld wijd aantast. Hoewel vervuiling natuurlijk kan zijn, zoals vulkanische as1, zijn menselijke activiteiten de belangrijkste oorzaak van de meeste vervuiling. Antropogene activiteiten zijn vervuilde grond, water en lucht, die direct of indirect leiden tot bijna 20.000.000 vroegtijdige menselijke sterfgevallen2 en decimeren miljarden andere vormen van leven per jaar. Verontreinigende stoffen zijn aanwezig, zelfs in de meest afgelegen gebieden van de planeet. Zware metalen en persistente organische verbindingen zijn bijvoorbeeld aangetroffen in diepzee ongewervelde dieren en polaire zoogdieren, respectievelijk3,4.

Mariene omgevingen zijn vooral getroffen door vervuiling. Lange tijd werd aangenomen dat de oceaan onaangetast zou blijven en een eindeloze bron van goederen zou leveren vanwege de enorme hoeveelheid water5. Om deze reden, alle soorten industrie en instellingen vrij vrijgegeven afval in waterlichamen voor de eeuwen6,7. Verschillende verontreinigingen van alle soorten, zoals plastic8, synthetische hormonen9, bestrijdingsmiddelen10, olie11, voedingsstoffen12, zware metalen3en radioactief afval13 zijn gerapporteerd als een impact Oceaan ecosystemen. In deze context behoren koraalriffen tot de belangrijkste en meest gevoelige ecosystemen in mariene omgevingen14. Riffen zijn kust beschermers, cruciaal voor de ontwikkeling van duizenden mariene soorten door het spelen van essentiële rollen in voedingsstoffen fietsen en klimaatbeheersing. Riffen dragen ook bij aan de economie door onder meer vis, goederen en toerisme te leveren, onder andere15. Bijvoorbeeld, 4.500.000.000 mensen zijn afhankelijk van Oceaan vissen als hun belangrijkste voedselbron16, die sterk worden ondersteund door koraalriffen.

Ongeacht hun ecologische, sociale en economische belang, worden koraalriffen met een gedecimeerd van17,18. Antropogene activiteiten zijn primair verantwoordelijk voor het bijdragen aan de drie belangrijkste oorzaken van de dood van koralen: klimaatverandering, overbevissing en waterverontreiniging19. Hoewel het belangrijk is om te werken aan de mitigatie van de opwarming van de aarde, is het ook belangrijk om te werken aan het minimaliseren van lokale vervuiling, inclusief watervervuiling, die kritisch kan bijdragen aan koraal daling20. Zo is er een dringende behoefte aan de ontwikkeling van strategieën om de levensduur van koralen te verhogen, wat hen extra tijd zou kunnen bieden om zich aan te passen en te overleven.

In dit opzicht is het uiterst belangrijk om oplossingen te vinden om besmetting te minimaliseren en om strategieën te ontwikkelen om de geschiktheid van koralen te verhogen. Strategieën voor de remediëren van mariene verontreinigende stoffen zijn zeer divers en kunnen worden gegroepeerd in fysische, chemische en biologische benaderingen. Fysieke benaderingen zijn nuttig. Ze zijn echter niet altijd efficiënt. Kunststofafval kan bijvoorbeeld worden geminimaliseerd door fysieke verwijdering, terwijl in water oplosbare stoffen andere methoden moeten worden geëlimineerd. Voorbeelden van dergelijke verbindingen zijn ruwe olie, vrijgegeven door de olie-industrie activiteiten en morsen, evenals andere Microverontreinigingen, zoals synthetische hormonen, normaal gebruikt als de oestrogene component in orale anticonceptiva en aanwezig zijn in riolering21, 22. het gebruik van chemische stoffen om besmetting te verminderen kan een specifiek probleem oplossen, maar het kan ook een extra bron van verontreiniging vormen. Dit is het geval met chemische dispergeermiddelen om olieverontreiniging te beperken, die als nog meer giftig voor mariene ecosystemen zijn beschreven dan de olieverontreiniging zelf23. Om deze redenen, biologische benaderingen presenteren verschillende voordelen in vergelijking met de andere methoden. Bioremediation is de capaciteit van levende organismen, of hun metabole producten, om verontreinigingen te transformeren in minder giftige of niet-toxische vormen24. De belangrijkste voordelen van het gebruik van biologische methoden zijn duurzaamheid, relatief lage kosten, het feit dat ze ecologisch vriendelijk zijn, en dat ze kunnen worden toegepast in verschillende ecosystemen, waardoor het milieu minimaal of minder wordt gebruikt21, 25,26,27.

Bovendien, de manipulatie van de microbiële Gemeenschap aanwezig in een omgeving maakt een extra potentieel voordeel. Er zijn microbiomen die zijn gekoppeld aan hosts en zijn essentieel voor hun gezondheid. Het is bekend dat deze geassocieerde symbiotische microbiomen noodzakelijk zijn om gastheer homeostase19te handhaven. De manipulatie van deze geassocieerde micro-organismen is goed onderzocht voor gastheren zoals planten en zoogdieren28,29, maar het gebruik van koraal probiotica is nog steeds roman15. Koralen hosten, interactie met, en zijn afhankelijk van grote en specifieke populaties van micro-organismen om te overleven19. De rol van deze microbiële gemeenschappen in de gezondheid en dysbiose van koralen is onder actieve studie, maar het is nog verre van volledig begrepen30. Een van de meest populaire hypotheses heet de koraal probiotische hypothese. Het suggereert het bestaan van een dynamische relatie tussen symbiotische micro-organismen en milieuomstandigheden die de selectie van de meest voordelige koraal metaorganismen31oplevert. Op basis van deze informatie, belangrijke potentiële probiotische mechanismen, evenals de strategieën voor isolatie, manipulatie, en levering van nuttige micro-organismen voor koralen (Bmc’s) voor verschillende doeleinden, werden voorgesteld32 en getest33. Deze potentiële gunstige kenmerken omvatten weerstand tegen temperatuurverhoging, bescherming tegen reactieve zuurstof soorten (ROS), stikstoffixatie, resistentie tegen verontreinigingen, en biologische controle tegen pathogenen, onder andere32.

Deze studie richt zich op de selectie van Bmc’s en vrij levende micro-organismen presenteren van de mogelijkheid om te degraderen twee verontreinigingen vaak gevonden in mariene omgevingen: de synthetische oestrogeen 17a-ethinylestradiol (EE2) en ruwe olie. Verontreinigende stoffen die hormoon actieve agentia bevatten zijn vaak aanwezig in waterlichamen34,35,36,37,38,39,40, 41,42. Onder hen, synthetische oestrogene Endocriene-disruptor verbindingen (edc’s) nabootsen van de werking van oestrogenen op doelcellen, waardoor verschillende effecten op dieren, met inbegrip van borstkanker, onvruchtbaarheid, en hermafroditisme9. EE2 wordt door de mens uitgescheiden vanwege het gebruik van orale anticonceptiva. Het wordt niet verwijderd uit afvalwater door traditionele afvalwaterzuiveringsinstallaties en heeft negatieve effecten, zelfs bij zeer lage concentraties (bv. ng/l of μg/l)43,44,45. Weinig is bekend over de effecten van oestrogenen op koraal fysiologie46,47. Echter, op andere mariene ongewervelde dieren, zoals sponzen, kreeftachtigen, en weekdieren, oestrogenen werden gemeld te veroorzaken verschillende negatieve effecten voornamelijk gerelateerd aan reproductie, zoals ontwikkeling en/of stimulatie van gameten, verandering in enzymatische en eiwit acties, problemen in embryonale processen, en anderen48,49,50,51,52. De negatieve gevolgen van EE2 besmetting wijzen op de noodzaak om duurzame benaderingen te ontwikkelen om deze verbinding uit het milieu te verwijderen zonder het mariene leven te beïnvloeden.

Parallel, met olie die momenteel bijna 40% van de wereldwijd verbruikte energiebronnen53, komen chronische verontreiniging en olielozingen vaak voor in de buurt van rifgebieden11. Olieverontreiniging werd gerapporteerd om negatieve effecten te veroorzaken bij verschillende soorten zeedieren, vogels, planten en mensen54,55,56,57. Op koralen, het veroorzaakt bleaching, vermindert de weerstand van larven tot thermische stress58, verstoort de microbiële geassocieerde gemeenschappen21, en veroorzaakt weefsel necrose. Bovendien zijn chemische dispergeermiddelen, een olie sanerings techniek die vaak door oliebedrijven wordt gebruikt om morsen te verhelpen, nog giftiger voor koralen dan de olie zelf23. Gunstige micro-organismen geïsoleerd van koralen, in tegenstelling, staan bekend om het spelen van cruciale rollen op gastheer gezondheid. Echter, de manipulatie van deze potentiële probiotica moet beter worden verkend om te onderzoeken van mogelijke negatieve bijwerkingen en de metabole capaciteiten die kunnen worden gescreend ter verbetering van de geschiktheid van het metaorganisme. In deze context, kenmerken zoals de antimicrobiële activiteit tegen koraal pathogenen, de productie van katalase om oxidatieve stress te bestrijden, het vermogen om ureum te degraderen (wat belangrijke rollen kan hebben in het calcificatie proces), en de aanwezigheid van genen die onder meer potentiële gunstige kenmerken verlenen, moeten de focus van het onderzoek zijn. Hier laten we zien hoe bioremediatie en probiotica kunnen worden gebruikt om gelijktijdig de effecten van vervuiling te verzachten en de gezondheid van koraal te verbeteren. De ontwikkeling van innovatieve benaderingen die kunnen worden gebruikt als interventies om de persistentie van de mariene soorten te verhogen, vormen een stap in de richting van een duurzamere en gezondere planeet.

Protocol

1. verzameling en opslag van water en koraal voor microbiële isolatie Opmerking: het is essentieel om de coördinaten en temperatuur van de bemonsteringsplaatsen te nemen. Indien mogelijk kunnen metagegevens zoals zoutgehalte, pH, diepte en lichtintensiteit ook helpen bij het vinden van fijnafgestemde teelt benaderingen en toekomstige interpretatie van gegevens. Voor betrouwbare resultaten, houd de monsters opgeslagen voor de minimale lengte van de tijd mogelijk. De water/koraal microbiomen kunnen aanzienlijk veranderen als de monsters niet op de juiste temperatuur worden gehouden en/of gedurende lange perioden worden opgeslagen. Als de isolatie stap niet onmiddellijk na het verzamelen wordt uitgevoerd, is het cruciaal om monsters bij 4 °C te houden tot de verwerking. Hoe langer de monsters worden opgeslagen, zelfs bij 4 °C, hoe meer de microbiële Gemeenschap zal veranderen. Monster en bewaar zeewater. Verzamel 500 mL watermonsters in ten minste driemaal per doel bemonsteringsplaats. Gebruik bij voorkeur steriele flessen met schroefdoppen. Als het water direct na het verzamelen wordt verwerkt, houdt u de flessen bij RT voor een kort interval. Als de monsterverwerking later plaatsvindt, houd de fles dan op 4 °C. Monster en bewaar het koraal. Gebruik een steriel paar tangen om koraal fragmenten van dezelfde bemonsteringsplaats van de watermonsters te snijden. Om besmetting te voorkomen, raak je koralen alleen aan met steriele handschoenen. Spoel het bemonsterde koraal fragment met 20 mL steriele zoutoplossing (3% NaCl in gedistilleerd water) of kunstmatig zeewater om zich te ontdoen van de losjes bevestigde vrij levende bacteriën van het zeewater. Gebruik de Tang en plaats elk koraal fragment in een steriele 250 − 500 mL container met een schroefdop die een steriele zoutoplossing bevat. Weeg 5 g koraal fragmenten in het laboratorium met steriele pincet en tangen met steriele 100 mm x 20 mm Petri schalen op een weegschaal. Breng het 5 g koraal monster over in een steriele mortel en maceraat het met behulp van een steriele stamper. Breng met behulp van een steriele spatel het maceraat monster over in een steriele kweek kolf met 45 mL 3% NaCl-steriele oplossing en 10 − 15 glas parels van 5 mm. gebruik een deel van de 45 mL steriele zoutoplossing om de mortel te wassen en de maximale hoeveelheid van de macerate te herstellen. Houd de kolven onder constante opwinding (150 x g) gedurende 16 uur bij de watertemperatuur van de bemonsteringsplaats.Opmerking: voor ondiepe water koralen zal de optimale temperatuur variëren van 24 − 28 °C. Deze stap zal micro-organismen loskoppelen van verschillende koraal compartimenten, zoals die verbonden zijn aan de gastheer cellen, of degenen die in het weefsel en het skelet leven. Na deze stap moeten de koraal maceraten niet worden opgeslagen en moet de isolatie stap onmiddellijk worden uitgevoerd. 2. isolatie van EE2-vernederende bacteriën uit zeewater en/of koralen Selecteer bacteriën.Opmerking: na de stappen 1.1.2 en 1.2.7 is de concentratie van micro-organismen in zeewater die loskomen van de verschillende koraal maceraten onbekend en variabel. Om de isolatie van individuele microbiële kolonies in Petri schaaltjes met agar-media te garanderen, zijn seriële verdunningen nodig. Voer seriële verdunningen tot 10-9 uit in steriele zoutoplossing voor koraal monsters en tot 10-6 voor watermonsters. Pipetteer verdunningen op en neer 5x voordat u de tip teruggooi. Vortex monsters voor 5 s elke keer voordat u de volgende seriële verdunning uitvoert. Pipetteer 100 μL van elke verdunning op Petri schaaltjes met 3% NaCl lysogeny Bouillon (lb) agar-medium en plaat ze.Opmerking: gebruik Marine agar (MA) als alternatief medium. Triplicaten van elke verdunning zijn vereist voor betrouwbare resultaten. Inbroed de platen gedurende 1 − 3 dagen bij de streef temperatuur (bijv. 26 °C). Controleer de platen eenmaal per dag. Selecteer en Isoleer de kolonies met de verschillende groei morfologieën op nieuwe platen met behulp van de streak-plaattechniek. Herhaal deze stap zo vaak als nodig is om zuivere kolonies op de platen te laten groeien. Als de procedure niet onmiddellijk wordt voortgezet naar stap 2.3.1, bewaart u isolaten bij 4 °C of in glycerol, zoals beschreven in paragraaf 2,2. Voorbereiding van glycerol-aandelen.Opmerking: deze stap is optioneel en kan worden gebruikt voor opslag op lange termijn bacteriële bestanden. Kies enkele kolonies van de verse plaat of van de platen opgeslagen op 4 °C en laat ze zelfstandig inoculeren in 2 mL steriel LB-medium. Plaats de buisjes onder constante opwinding (150 x g) bij 24 − 28 °c ‘s nachts (aan). Voeg 1 mL van de bacteriële culturen toe van stap 2.2.2 en steriele glycerol tot een eindconcentratie van 20% op de 2 mL cryoflesjes. Laat de cryoflesjes op 4 °C staan. Plaats de bacterie bestanden van glycerol bij-80 °C tot dat nodig is. Voer de EE2-degradatie ability test uit. Activeer de isolaten in lb Bouillon of alternatieve media. Kies hiervoor een enkele kolonie van de verse platen of de plaat opgeslagen op 4 °C, en inoculeren 2 mL steriel LB-medium. In het geval dat het een glycerol-kolf is, moet het eerst op LB agar-platen worden uitgebroed en bij 24 − 28 °C worden geïninat om enkele kolonies te laten groeien. Plaats de buis met LB medium hellend onder constante opwinding (150 x g) bij 24 − 28 °c op. Na bacteriële groei, pellet de cellen door ze te centrifugeren op 8.000 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi de supernatant weg en, zachtjes pipetteren op en neer, regeer de cellen in een gelijk volume (2 mL) zout water om de resterende LB Bouillon te wassen. Herhaal stap 2.3.2 tweemaal om te garanderen dat er geen sporen van koolstofbron, het opschorten van de cellen in een gelijk volume van zoutoplossing. Bijvoorbeeld, als het werd gestart met een 2 mL cultuur, respendeert de cellen in een laatste volume van 2 mL zoutoplossing. Beënt de gewassen en geresuspendeerde cellen in minimaal Bushnell Haas Culture medium (BH Broth) met EE2 als enige koolstofbron59.Opmerking: EE2 wordt opgelost in ethanol in een uiteindelijke concentratie van 5 mg/L in het kweekmedium. Breng indien nodig wijzigingen aan in het verontreinigings type en/of de concentratie. Beoordeling van bacteriële groei door optische dichtheid bij 600 nm en/of kolonies vormende eenheden (CFU) op LB agar medium33, voor 16 − 72 uur incubatie.Opmerking: als alternatief kunnen de micro-organismen direct worden geïsoleerd op minimale media met EE2, of andere verbindingen, als de enige koolstofbron. Deze stap zou de selectie te richten en te voorkomen dat ongewenste groei. 3. isolatie van olie-vernederende bacteriën uit zeewater en/of koralen Bereid minimale media met een in water oplosbare fractie (oWSF) en olie water-onoplosbare fractie (oWIF) als de enige koolstofbron21. Voeg 1 − 2% ruwe olie toe aan 500 mL steriel gedestilleerd water. Gebruik een filter kolf die op de bodem is geopend om de oplosbare fractie uit te nemen zonder de bovenste laag van de onoplosbare fractie te verstoren. Houd het mengsel onder constante opwinding bij 24 − 28 °C bij 150 x g voor 48 h. Plaats de filter kolf met de ruwe olie fracties op een stabiel oppervlak en wacht 10 − 20 min om oplosbare en onoplosbare breuk scheiding mogelijk te maken. Breng de oWSF over naar een nieuwe steriele kolf en spaar de oWIF door de onderste filter kolf te openen en de oplosbare fractie uit te nemen. Met behulp van alle oWSF hersteld in de vorige stap (~ 400 mL), bereid 1 L van BH agar minimum medium met oWSF als de enige koolstofbron. Gebruik het oWIF overgebleven in de kolf van stap 3.1.4 en bereid 1 L BH agar minimum medium met oWIF als enige koolstofbron voor. Isoleer oWSF-en oWIF-vernederende bacteriën. Met behulp van water en koraal maceraat van respectievelijk stappen 1.1.2 en 1.2.7, Verdun de monsters tot 10-6 in steriele zoutoplossing zoals beschreven in stap 2.1.1. Pipetteer 100 μL van elke verdunning op Petri schaaltjes met BH-oWSF en BH-oWIF agar media en plaat ze. Herhaal de procedures die worden beschreven in stap 2.1.3 tot en met stap 2.1.5. 4. selectie van consortium leden Extraheer en volg het DNA voor taxonomische identificatie. Activeer de in glycerol opgeslagen isolaten zoals beschreven in stap 2.3.1. Pak het DNA uit met behulp van een DNA-extractie Kit (Zie tabel met materialen). Gebruik primers 27f (5 ′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3 ′) en 1492r (5 ′-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ′) voor versterking van het 16S rRNA-gen. Voer 50 μL PCR-reacties uit volgens het volgende Protocol: 5 μL van 10x polymerase buffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mm dNTPs, 5 mm van elke primer, 10 ng van genomisch dna en 2,5 U van Taq-DNA-polymerase. Voeg negatieve controles (d.w.z. Blanco DNA-extracties en PCR-reacties zonder template-DNA) toe om ervoor te zorgen dat er geen besmetting is. Stel de volgende thermische fiets stappen in: een eerste denaturatiecyclus bij 94 °C gedurende 4 minuten; 35 cycli bij 94 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door 50 °C gedurende 1 minuut en 72 °C gedurende 2,5 min; een laatste Verleng cyclus gedurende 10 minuten bij 72 °C. Controleer de integriteit van ampliconlengte voor temp in 1,2% agarose gel met 80 V. Gel zuivert de monsters met een gel-zuiverings pakket (Zie tabel met materialen). Kwantiseer PCR-producten met een fluor meter. Product verzenden voor sequentiëren.Opmerking: voor betere taxonomische classificaties wordt de Sanger-methode aanbevolen60, omdat deze lange sequenties biedt. De universele primers 27f en 1492r kunnen worden gebruikt om de gehele lengte van de 16S rRNA Gene61te versterken. Als contigs niet kunnen worden geassembleerd met behulp van één paar primers, moet een extra paar in het midden van de sequentie worden overwogen. Bepaal de groeicurve. Activeer de isolaten in glycerol-voorraden van stap 2.2.5 zoals beschreven in stap 2.3.1 maar met 5 mL in plaats van 2 mL. Voeg 1% (v/v) van de gekweekte 5 mL cultuur uit stap 4.2.1 in triplicaten toe aan een kolf van 250 mL die 100 mL 3% LB media bevat. Zorg ervoor dat u ook triplicaten van een negatieve controle (geen entmateriaal) voorbereidt. Plaats de kolven in een incubator onder constante opwinding (150 x g) bij 24 − 28 °c. Neem 1 mL aliquots elke 4 h voor 48 h. Als de stammen een hoge groeisnelheid presenteren, verlaagt u het interval van 4 uur. Meet de schatting van de optische dichtheid (OD) bij 600 nm golflengte en kolonie vormende eenheden (CFU) geteld van seriële verdunningen op Rich Media platen (100 μL moet in elke plaat worden geënt en genormaliseerd naar het volume van 1 mL). Plot de OD-en CFU-curven en analyseer de correlatie van OD/CFU van elke afzonderlijke stam. Bereken vanaf nu het aantal cellen op basis van de OD-waarden. Voer antagonisme-test uit. Activeer de isolaten zoals beschreven in stap 2.3.1. Inoculeren één stam op een tijdstip langs het midden van platen met agar-media en de andere in loodrecht op de centrale. Herhaal dit totdat elke geselecteerde microbiële stam is getest tegen alle andere. Inbroed de platen bij 24 − 28 °C en bewaak ze dagelijks om mogelijke halo’s te observeren die een antagonistische activiteit aanduiden. Als halo’s worden waargenomen die antagonistische activiteit tussen twee stammen aangeven, moet een van hen worden uitgesloten. Consortium assembly uitvoeren. Activeer de isolaten zoals beschreven in stap 2.3.1. Pellet de cellen op 3.500 x g en spoel ze zachtjes 2x in een gelijk volume zoutoplossing. Respendeer de cellen in een gelijk volume (d.w.z., als het uiteindelijke volume 2 mL cellen was, was ze met 2 mL zoutoplossing en respendeer ze in een laatste volume van 2 mL). Inoculeren 1 mL cultuur in 100 mL 3% NaCl LB medium en geïnculeerd op 150 x g. Herhaal stap 4.5.2, inoculeren van de 100 mL geteeld, gewassen, en geresuspendeerde culturen in 10 L culturen. Inincuberen in steriele lucht-Lift bioreactoren, die gefilterde lucht van een pomp ontvangen. Als er meer cultuur nodig is, wordt altijd 1% van de gekweekte cultuur in verse media geënt. Centrifugeer gekweekte culturen bij 8.000 x g gedurende 8 minuten bij 4 °c. Gooi de supernatant na het centrifugeren weg. Was de pellet, resuspenseer zachtjes de cellen in 500 mL steriele zoutoplossing. Herhaal de stappen 4.5.5 en 4.5.6. Respendeer elke individuele cultuur in 100 mL zoutoplossing en meet de OD om het aantal cellen te schatten. Bereken het volume van elke kweek die nodig is om een eindconcentratie van 107 cellen ml-1te bereiken. Voer CFU-tellingen uit op Rich media voor een definitieve bevestiging van de levensvatbaarheid en concentratie van cellen. Meng een gelijk volume van elke individuele cultuur in steriele kolven en aliquot het consortium in 50 mL steriele buizen. Bewaren bij 4 °C tot inoculatie.Opmerking: bereid de assembly van het consortium zo vers mogelijk om te garanderen dat cellen nog steeds levensvatbaar zijn. Als alternatief kunnen CFU tellingen worden uitgevoerd voor de inoculatie. Om een ideaal consortium samen te stellen, is het noodzakelijk om isolaten te gebruiken die verschillende en complementaire metabole capaciteiten vertonen. Gewoonlijk worden 6 − 10 isolaten gebruikt om consortia te vormen, maar dit aantal zal variëren afhankelijk van de kenmerken en doeleinden van de leden. 5. detectie van putatieve heilzame eigenschappen voor koralen Activeer de isolaten van de glycerol-voorraden door ze op LB-agar-platen te laten vallen en hen te bebroed bij 24 − 28 °C, om enkele kolonies te laten groeien. Kies een enkele kolonie van de platen en inoculeren in 2 mL steriel LB medium. Plaats buis met LB medium hellend onder constante opwinding (150 x g) bij 24 − 28 °c op. Voer DNA-extractie uit zoals beschreven in punt 4,1 voor de detectie van potentieel heilzame genen door PCR.Opmerking: PCR-reactie condities en primers zullen afhangen van het beoogde gen. In tabel 1worden methodologieën beschreven voor het testen van BMC-kenmerken van individuele stammen en PCR-detectie voor potentieel heilzame genen.

Representative Results

Op basis van de hier beschreven methoden was het mogelijk om micro-organismen te isoleren van verschillende waterbronnen en koraal nubbins die putatieve BMC-kenmerken vertonen en in staat zijn om verschillende klassen van verontreinigingen te degraderen (Figuur 1). Met behulp van watermonsters verzameld in een zuiveringsinstallatie, verkregen van CESA-UFRJ (experimentele centrum van milieusanering van de federale universiteit van Rio de Janeiro), en op basis van de hier gepresenteerde procedure, 33 bacteriële stammen kunnen degraderen EE2 bij een eindconcentratie van 5mg/L was geïsoleerd (Figuur 2A). Bovendien, met behulp van de techniek voor het selecteren van olie-vernederende bacteriën, 20 stammen kunnen degraderen zowel owsf (Figuur 2B) en owif (Figuur 2C) werden geïsoleerd. Putative BMC kenmerken werden gescreend in micro-organismen geïsoleerd van verschillende koraal soorten onder diverse omstandigheden. Onder hen, een stam die sterke antagonistische activiteit tegen de koraal pathogenen Vibrio coralliilyticus (Figuur 3a), stammen kunnen degraderen ureum (Figuur 3B), een goede katalase producent (Figuur 3 C), en micro-organismen die mogelijk heilzame genen vertonen (Figuur 3D) werden aangetroffen. Gebruikmakend van de twee benaderingen gecombineerd (dat wil zeggen, bioremediatie en BMC inoculatie), was het mogelijk om koralen te beschermen tegen de impact van olie blootstelling. Hiervoor werd een olie bioremediator pBMC consortium, geïsoleerd van de koraal Mussismilia harttii, geïnoculeerd op koraal nubbins blootgesteld aan 1% olie in triplicaten21. De behandelingen blootgesteld aan olie presenteerde een progressieve afname van FV/FM vanaf de vierde dag, het bereiken van waarden dicht bij nul door de tiende dag. Variabele fluorescentie/maximale fluorescentie (FV/FM) voorzag in een maat voor de maximale photosystem II (PSII) fotochemische efficiëntie van de zooxanthellae, die een indirecte meting van de koraal gezondheid representeren. Aan de andere kant toonden koraal nubbins in de aquaria die met het consortium zijn geënt een beter bewaarde fotochemische vaardigheid (Figuur 4). Figuur 1: samenvatting van de belangrijkste stappen van een bioremediator-pBMC consortium selectie en assemblage. Schema van de selectie stappen voor het vervuilende micro-organismen (in grijs) en de laatste stappen die worden gebruikt voor de microbiële selectie van het consortium (DNA-sequencing, groeicurve, antagonisme-test en consortium assemblage in het rood). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: selectie van vervuilende bacteriën. A) bacteriële isolaten die op minimale media platen met EE2 als enige koolstofbron groeien. B) bacterie kolonies die op minimale media platen met oWSF als enige koolstofbron groeien. C) bacterie kolonies die op minimale media platen met oWIF als enige koolstofbron groeien. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: detectie van pBMC-kenmerken. A) vlekken in triplicaten van stam die antagonistische activiteit vertonen tegen het koraal pathogeen Vibrio coralliilyticus (in het zwart) en een controlestam (in het groen). B) stammen die op media met ureum als enige koolstofbron groeien. (C) stam producerende katalase (+) en een slechte katalase-producerende stam (-). D) voorbeeld van PCR-detectie van het Nirk-gen (baan 1 = 1kb-ladder; Lane 2 = blanco DNA-extractie negatieve controle; Lane 3 = Nirk-detectie; Lane 4 = PCR-reacties zonder template-DNA). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: fv/FM-metingen van M. harttii nubbins donker-aangepast om 5 uur, met behulp van een duik-pam chlorofyl fluor meter. FV/FM-metingen van de behandelingen controle consortium, olie en olie met consortium werden uitgevoerd in triplicates elke dag voor 10 dagen. Standaarddeviatie wordt weergegeven. Functies van de grafiek zijn gewijzigd met toestemming van eerdere resultaten21, beschikbaar op https://www.Nature.com/articles/srep18268 onder een Creative Commons naamsvermelding 4,0. Volledige voorwaarden op http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Moa Microorganism Detectietechniek Verwijzingen Klimaat regulering; surfur Cycling; antimicrobiële verbindingen; verhoging van de antioxidant bescherming van cellen. Aspergillus sydowii PCR voor dddP gen 81 Pseudovibrio SP. p12 Cultuurmedium met DMSP 82 Pseudoalteromonas SP. PCR voor dmdA gen 33 Biologische regulering van pathogenen. Microbiome van Acropora palmata slijm Duidelijke zone van remming 83 Extracten van koralen Groeiremming assay 84 Marinobacter SP. Swarming assays 85 Pseudoalteromonas SP. Agar plaat cross-streaking 86 Pseudoalteromonas SP. Agar-diffusie methode 33 Voordeel voor het calcificatie proces; bron van stikstof voor scleractinian koralen. Symbiodinium spp. Colorimetrische methode 87 Microbiome van Stylophora pistillata slijm ___ 88 Microbiome van Acropora alciminata Methode door Bolland et al. 80 89 Stikstof cyclus; Stikstof fixatie verhogen. Microbiële Gemeenschap qPCR 90 Microbiële Gemeenschap Pcr 91 Microbiële Gemeenschap qPCR 92 Microbiële Gemeenschap Aangepaste acetyleen (C2H2) reductie techniek 93 Pseudoalteromonas SP. en Halomonas taeanensis Pcr 33 Stikstof cyclus; afname van de ammonium concentratie. Pseudoalteromonas SP. Pcr 33 Microbiome van tubastraea zwam Pcr 94 Microbiome van Xestospongia testudinaria Voorspellende meta-analyse 95 Holobiont bescherming tegen reactieve zuurstof soorten (ROS). Pseudoalteromonas SP., Cobetia Marina en Halomonas taeanensis Catalase-test 33 Symbiodinium spp. Amplex rood 96 Vibrio Pelagius en sync-chococcus SP. Mierikswortelperoxidase-scopoletin methode 97 Vibrio fischeri Meerdere methoden 98 Tabel 1: detectie van putatieve BMC-kenmerken, werkingsmechanisme (MOA), gerapporteerde micro-organismen die het potentieel en de techniek presenteren die worden gebruikt om het kenmerk te detecteren.

Discussion

Bioremediation benaderingen zijn massaal verkend in de afgelopen 50 jaar. Zo zijn meer dan 200 microben bij bacteriën, cyanobacteriën, microalgen en schimmels in verschillende habitats aangewezen als zijnde in staat om de aanwezigheid en/of degraderen olie koolwaterstoffen aan te duiden62,63,64 . Bovendien zijn andere klassen van verbindingen die gevolgen voor het milieu en de mens veroorzaken, zoals plastic, Bisfenol A, hormoonontregelaars en zware metalen, doelstellingen voor de ontwikkeling van bioremediatie techniek65,66, 67. Aan de andere kant, mariene probiotische ontwikkeling is beperkt tot de velden die een duidelijke invloed hebben op de economie, zoals vis probiotica in aquacultuur68,69. Isolatie en karakterisering van nuttige micro-organismen ter bescherming van koraalriffen, mariene ecosystemen die visserij, toerisme en andere winstgevende activiteiten ondersteunen, beginnen echter15te worden. Hier is een goedkoop, gemakkelijk en toegankelijk protocol om vervuilende micro-organismen te selecteren die ook potentieel gunstige kenmerken kunnen opleveren voor lokale mariene ecosystemen, met name putatieve nuttige micro-organismen voor koralen (pBMCs), Beschreven.

Bovendien, de methode die hier gedemonstreerd is zeer aanpasbaar aan verschillende verbindingen en diverse soorten microbiële bronnen. Het is mogelijk om verschillende verontreinigende stoffen te richten door de enige koolstofbron die wordt toegevoegd aan de minimale media te vervangen. Hiervoor, in plaats van olie of EE2, andere verbindingen moeten worden toegevoegd op de gewenste concentratie. Dit zou de selectieve druk zijn om degraders te isoleren voor de beoogde verontreinigende stoffen. Bijvoorbeeld, micro-organismen die in staat zijn om andere klassen van hormoonontregelende stoffen te vernederen, zijn al geselecteerd en getest met dezelfde methodologie70. Bovendien kunnen andere mariene en terrestrische organismen, zoals sponzen en planten71,72, alsmede verschillende soorten milieu monsters, zoals bodem, brandstof en rotsen, worden gebruikt als de vernederende microbiële bronnen25, 73,74. Zo was het mogelijk om koolwaterstof-vernederende bacteriën te detecteren en te isoleren uit verschillende bodem-en sedimentmonsters25,54,63,64,75. Ten slotte, het uitvoeren van kleine wijzigingen in de media, andere micro-organismen dan bacteriën kunnen gemakkelijk worden geselecteerd als de vernederende-microben. Bijvoorbeeld, een microalgen stam met de mogelijkheid om efficiënt degraderen oestrogeen verbindingen is gemeld76.

Idealiter, bioremediation-probiotische consortia moeten worden geassembleerd voor elke specifieke compound of gebied. Microben die in een specifieke omgeving groeien kunnen niet zo goed groeien in nieuwe sites in vergelijking met hun eigen omstandigheden. Omdat onderzoekers geen product hebben gevonden dat onder alle verschillende omgevingsomstandigheden efficiënt kan worden toegepast, moeten voor elke specifieke situatie nieuwe consortia worden uitgevoerd. Dit zou vergelijkbaar zijn met gepersonaliseerde geneeskunde voor milieu-op maat gemaakte herstel. Om deze reden, de oprichting van een centrale bank van microbiële stammen met potentiële probiotische kenmerken en degradatie capaciteit is een cruciale stap voor de voortgang van dit veld. Dit initiatief bespaart tijd en werk en draagt bij aan de samenstelling van nieuwe specifieke consortia wereldwijd.

Micro-organismen in verband met koralen (dat wil zeggen, microalgen, bacteriën, Archaea, schimmels, en virussen) hebben een complexe en ingewikkelde rol in het handhaven van gastheer homeostase19. Milieustressoren, zoals vervuiling, kan ook destabiliseren het koraal microbiome, resulterend in dysbiosis, die kan leiden tot ziekte en sterfte30. De mechanismen waarmee het koraal microbiome koraal gezondheid kan ondersteunen beginnen te worden onthuld. Deze mechanismen zijn de sleutel tot het begrijpen van koraal resistentie en weerstand tegen milieustressoren en, bijgevolg, het bevorderen van rif persistentie en conservering. Bovendien, bevindingen in het veld zal helpen om te begrijpen van algemene gastheer-microbiome interacties, die kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van betere probiotica en gezondheidsbevorderende strategieën in andere gebieden. Het is ook belangrijk om beter te onderzoeken hoe deze probiotica inoculaties kunnen interfereren met de gezondheid van het metaorganisme tijdens stressgebeurtenissen. Bijvoorbeeld, werk waaruit blijkt dat de augmentatie in koraal prestaties is te wijten aan de probiotica en niet alleen het koraal met behulp van bacteriën als een voedselbron zijn nog steeds nodig.

Parallel hieraan zijn de ontwikkeling van nieuwe consortia van aanpak en de verbetering van de bestaande, van groot belang. Alternatieve methoden voor consortium immobilisatie en innovatieve benaderingen, zoals het inoculeren van koraal voedsel (d.w.z. Artemia en rotifers) en het gebruik ervan als vectoren, zijn veelbelovend. Deze leveringssystemen kunnen ook worden aangepast aan andere mariene organismen te richten en zal essentieel zijn voor het succes van de mariene probiotica veld.

Vervuiling mitigatie en koraal rif persistentie zijn momenteel twee van de belangrijkste onderwerpen in milieu conferenties regelmatig benadrukt. De agenda 2030, een document gepubliceerd door de Verenigde Naties waarin de Global goals Society wordt beschreven, moet reiken tot een duurzame toekomst, de specifieke doelstellingen voor elk probleem aan de kaak stellen. Terwijl doel 6 het belang van verbetering van de waterkwaliteit benadrukt door de vervuiling te verminderen, versterkt doelstelling 14 de relevantie van instandhouding en duurzaam gebruik van de oceanen, zeeën en mariene hulpbronnen77. In deze context is het behoud van koraalriffen afhankelijk van veranderingen die in de nabije toekomst moeten worden gerealiseerd, inclusief mitigatie van verontreiniging. Dit is van groot belang, omdat de meeste massale koraal verliezen plaatsvonden toen andere factoren werden toegevoegd aan klimaat gebeurtenissen, zoals vernietiging van lokale habitats en verontreiniging78,79. Dit document toonde aan dat het mogelijk is om bioremediatie en pBMC-inoculatie te combineren om specifieke verontreinigende stoffen te degraderen, terwijl het de weerstand en veerkracht van koraal kan verhogen om met verontreinigende stoffen en andere problemen om te gaan. De optimalisering van bestaande protocollen en/of de ontwikkeling van innovatieve methoden, gecombineerd of onafhankelijk toegepast, zal cruciaal zijn om de toekomst van mariene ecosystemen te bepalen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd uitgevoerd in samenwerking met het lopende R & D-project geregistreerd als ANP 21005-4, “PROBIO-DEEP-Survey van potentiële effecten veroorzaakt door olie-en gasexploratie op diepzee mariene holobionten en selectie van potentiële bioindicatoren en bioremediatie processen voor deze ecosystemen “(UFRJ/shell Brasil/ANP) –” Probio-Deep-levantamento de potenciais impactos causados pela exploração de óleo e Oil em holobiontes marinhos em Mar profundo e seleção de potenciais bioindicadores e processos biorremediadores para Esses ecossistemas “, gesponsord door Shell Brasil onder de ANP R & D Levy als” Compromisso de Investimentos com pesquisa e Desenvolvimento. De auteurs danken ook Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) en Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior (CAPES) voor financiële steun, en aan Camila Messias, Phillipe Rosado en Henrique Fragoso dos Santos, voor de geleverde afbeeldingen.

Materials

500 mL PYREX Media Storage Bottle thomas scientific/Corning 1743E20/1395-500 Used to sample water.
500 mL Aspirator Bottles thomas scientific/Corning 1234B28/1220-2X Used to separate the oil fractions.
6-inch wire cutter plier thomas scientific/Restek 1173Y64/23033 Used to cut coral fragments.
17a-Ethinylestradiol LGC Standards DRE-C13245100 Used as the only carbon source to make the selective media.
Agar Himedia PCT0901-1KG Used to make solid media.
Bushnell Haas Broth Himedia M350-500G Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.
Erlenmeyer Flask thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble) 4882H35/26500-125 Used to incubate coral macerate with glass beads.
GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit GE Healthcare 28903470 Used to purify PCR products before sending them for sequencing.
Glass Beads MP Biomedicals 1177Q81/07DP1070 Used to detach the microorganisms from coral structures.
Laminar Flow Hood Needed to work at sterile conditions.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth) Himedia M1245-1KG Used as rich media to grow bacteria.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar) Himedia M384-500G Used as rich media to grow bacteria.
Orbital-Shaker Incubator Used to incubate liquid media and oil.
Plates Incubator Used to incubate plates.
Porcelain Mortar and Pestle Thomas scientific/United Scientific Supplies 1201U69/JMD150 Used to macerate coral fragments.
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.
Refrigerated Centrifuge Used to centrifuge bacterial cultures.
Spectrophotometer Used to measure optical density of bacterial cultures.
Wizard Genomic DNA Purification kit Promega A1120 Used for microbial strains DNA extraction.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durand, M., Grattan, J. Effects of volcanic air pollution on health. Lancet. 357, 164 (2001).
  2. Ramaswami, A., Russell, A. G., Culligan, P. J., Sharma, K. R., Kumar, E. Meta-principles for developing smart, sustainable, and healthy cities. Science. 352, 940-943 (2016).
  3. Dökmeci, A. H., Yildiz, T., Ongen, A., Sivri, N. Heavy metal concentration in deepwater rose shrimp species (Parapenaeus longirostris, Lucas, 1846) collected from the Marmara Sea Coast in Tekirdağ. Environmental Monitoring and Assessment. 186, 2449-2454 (2014).
  4. Skaare, J. U., et al. Ecological risk assessment of persistent organic pollutants in the arctic. Toxicology. 181-182, 193-197 (2002).
  5. Garstang, W. The impoverishment of the sea. A critical summary of the experimental and statistical evidence bearing upon the alleged depletion of the trawling grounds. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 6, 1-69 (1900).
  6. Korajkic, A., Brownell, M. J., Harwood, V. J. Investigation of human sewage pollution and pathogen analysis at Florida Gulf coast beaches. Journal of Applied Microbiology. 110, 174-183 (2011).
  7. Liu, J., Yang, W. Water sustainability for China and beyond. Science. 337, 649-650 (2012).
  8. Eriksen, M., et al. Plastic pollution in the world’s oceans: more than 5 trillion plastic pieces weighing over 250,000 tons afloat at sea. PLoS One. 9, 111913 (2014).
  9. Vilela, C. L. S., Bassin, J. P., Peixoto, R. S. Water contamination by endocrine disruptors: Impacts, microbiological aspects and trends for environmental protection. Environmental Pollution. 235, 546-559 (2018).
  10. Ueno, D., et al. Global pollution monitoring of PCBs and organochlorine pesticides using skipjack tuna as a bioindicator. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45, 378-389 (2003).
  11. Villela, H. D. M., Peixoto, R. S., Soriano, A. U., do Carmo, F. L. Microbial bioremediation of oil contaminated seawater: A survey of patent deposits and the characterization of the top genera applied. Science of the Total Environment. 666, 743-758 (2019).
  12. Rabalais, N. N., et al. Eutrophication-driven deoxygenation in the coastal ocean. Oceanography. 27, 172-183 (2014).
  13. Calmet, D. P. Ocean disposal of radioactive waste. Status report. IAEA Bulletin. 31, 47-50 (1989).
  14. Swart, P. K. Coral Reefs: Canaries of the Sea, Rainforests of the oceans. Nature Education Knowledge. 4, 5 (2013).
  15. National Academies of Sciences and Medicine, E. . A Research Review of Interventions to Increase the Persistence and Resilience of Coral Reefs. , (2019).
  16. Béné, C., et al. Feeding 9 billion by 2050-Putting fish back on the menu. Food Security. 7, 261-274 (2015).
  17. Hughes, T. P., et al. Global warming and recurrent mass bleaching of corals. Nature. 543, 373 (2017).
  18. Hughes, T. P., et al. Spatial and temporal patterns of mass bleaching of corals in the Anthropocene. Science. 359, 80-83 (2018).
  19. Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., Zilber-Rosenberg, I. The role of microorganisms in coral health, disease and evolution. Nature Reviews Microbiology. 5, 355 (2007).
  20. Shaver, E. C., Burkepile, D. E., Silliman, B. R. Local management actions can increase coral resilience to thermally-induced bleaching. Nature Ecology & Evolution. 2, 1075-1079 (2018).
  21. Santos, H., et al. Impact of oil spills on coral reefs can be reduced by bioremediation using probiotic microbiota. Scientific Reports. 5, 18268 (2015).
  22. Whitman, W. B. Bacteria and the fate of estrogen in the environment. Cell Chemical Biology. 24, 652-653 (2017).
  23. DeLeo, D. M., Ruiz-Ramos, D. V., Baums, I. B., Cordes, E. E. Response of deep-water corals to oil and chemical dispersant exposure. Deep-Sea Research. Part II Topical Studies in oceanography. 129, 129-147 (2016).
  24. Zinicovscaia, I., Cepoi, L. . Cyanobacteria for bioremediation of wastewaters. , (2016).
  25. Cury, J. C., et al. Microbial diversity and hydrocarbon depletion in low and high diesel-polluted soil samples from Keller Peninsula, South Shetland Islands. Antarctic Science. 27, 263-273 (2015).
  26. Sinha, R. K., Valani, D., Sinha, S., Singh, S., Herat, S. Bioremediation of contaminated sites: a low-cost nature’s biotechnology for environmental clean up by versatile microbes, plants, earthworms. Solid Waste Management and Environmental Remediation. , 971-978 (2009).
  27. Maila, M. P., Cloete, T. E. Bioremediation of petroleum hydrocarbons through landfarming: Are simplicity and cost-effectiveness the only advantages. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 3, 349-360 (2004).
  28. Madsen, K., et al. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology. 121, 580-591 (2001).
  29. Saleem, M., Arshad, M., Hussain, S., Bhatti, A. S. Perspective of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) containing ACC deaminase in stress agriculture. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 34, 635-648 (2007).
  30. Sweet, M. J., Bulling, M. T. On the importance of the microbiome and pathobiome in coral health and disease. Frontiers in Marine Science. 4, 9 (2017).
  31. Reshef, L., Koren, O., Loya, Y., Zilber-Rosenberg, I., Rosenberg, E. The coral probiotic hypothesis. Environmental Microbiology. 8, 2068-2073 (2006).
  32. Peixoto, R., Rosado, P. M., Leite, D. C. d. e. A., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial Microorganisms for Corals (BMC): Proposed Mechanisms for Coral Health and Resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
  33. Rosado, P., et al. Marine probiotics: increasing coral resistance to bleaching through microbiome manipulation. The The ISME Journal. 13, 921-936 (2019).
  34. Heberer, T., Reddersen, K., Mechlinski, A. From municipal sewage to drinking water: fate and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment in urban areas. Water Science and Technology. 46, 81-88 (2002).
  35. Barel-Cohen, K., et al. Monitoring of natural and synthetic hormones in a polluted river. Journal of Environmental Management. 78, 16-23 (2006).
  36. Balest, L., Mascolo, G., Di Iaconi, C., Lopez, A. Removal of endocrine disrupter compounds from municipal wastewater by an innovative biological technology. Water Science and Technology. 58, 953-956 (2008).
  37. Liu, Z., Kanjo, Y., Mizutani, S. A review of phytoestrogens: Their occurrence and fate in the environment. Water Research. 44, 567-577 (2010).
  38. Chapman, H. F., et al. A national approach to health risk assessment, risk communication and management of chemical hazards from recycled water. Waterlines. 48, (2011).
  39. Rocha, M. J., Cruzeiro, C., Ferreira, C., Rocha, E. occurrence of endocrine disruptor compounds in the estuary of the Iberian Douro River and nearby Porto Coast (NW Portugal). Toxicological and Environmental Chemistry. 94, 252-261 (2012).
  40. Nie, M., et al. Environmental estrogens in a drinking water reservoir area in Shanghai: occurrence, colloidal contribution and risk assessment. Science of the Total Environment. 487, 785-791 (2014).
  41. Ribeiro, C., Ribeiro, A. R., Tiritan, M. E. Priority substances and emerging organic pollutants in Portuguese aquatic environment: a review. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 238, 1-44 (2016).
  42. Wu, C., Huang, X., Lin, J., Liu, J. Occurrence and fate of selected endocrine-disrupting chemicals in water and sediment from an urban lake. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 68, 225-236 (2015).
  43. Shi, W., Wang, L., Rousseau, D. P. L., Lens, P. N. L. Removal of estrone, 17α-ethinylestradiol, and 17ß-estradiol in algae and duckweed-based wastewater treatment systems. Environmental Science and Pollution Research. 17, 824-833 (2010).
  44. Ternes, T., Bonerz, M., Schmidt, T. Determination of neutral pharmaceuticals in wastewater and rivers by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 938, 175-185 (2001).
  45. Ternes, T. A., Andersen, H., Gilberg, D., Bonerz, M. Determination of estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS. Analytical Chemistry. 74, 3498-3504 (2002).
  46. Tarrant, A. M., Atkinson, M. J., Atkinson, S. Effects of steroidal estrogens on coral growth and reproduction. Marine Ecology Progress Series. 269, 121-129 (2004).
  47. Atkinson, S., Atkinson, M. J., Tarrant, A. M. Estrogens from sewage in coastal marine environments. Environmental Health Perspectives. 111, 531-535 (2003).
  48. Schoenmakers, H. J. N., Van Bohemen, C. G., Dieleman, S. J. Effects of Oestradiol-17 β on the Ovaries of the Starfish Asterias rubens. Development Growth and Differentiation. 23, 125-135 (1981).
  49. Sarojini, R., Jayalakshmi, K., Sambashivarao, S. Effect of external steroids on ovarian development in freshwater prawn, Macrobrachium lamerrii. Journal of Advanced Zoology. 7, 50 (1986).
  50. Hathaway, R. R., Black, R. E. Interconversions of estrogens and related developmental effects in sand dollar eggs. General and Comparative Endocrinology. 12, 1-11 (1969).
  51. Ghosh, D., Ray, A. K. Subcellular action of estradiol-17β in a freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. General and Comparative Endocrinology. 90, 274-281 (1993).
  52. Aris, A. Z., Shamsuddin, A. S., Praveena, S. M. occurrence of 17α-ethynylestradiol (EE2) in the environment and effect on exposed biota: a review. Environment International. 69, 104-119 (2014).
  53. International Energy Agency. . Key World Energy Statistics (KWES). , (2018).
  54. Carmo, F. L., et al. Bacterial structure and characterization of plant growth promoting and oil degrading bacteria from the rhizospheres of mangrove plants. Journal of Microbiology. 49, 535-543 (2011).
  55. Piatt, J. F., Lensink, C. J., Butler, W., Kendziorek, M., Nysewander, D. R. Immediate impact of the’Exxon Valdez’oil spill on marine birds. The Auk. 107 (2), 387-397 (1990).
  56. White, H. K., et al. Impact of the Deepwater Horizon oil spill on a deep-water coral community in the Gulf of Mexico. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20303-20308 (2012).
  57. Abdel-Shafy, H. I., Mansour, M. S. M. A review on polycyclic aromatic hydrocarbons: source, environmental impact, effect on human health and remediation. Egyptian Journal of Petroleum. 25, 107-123 (2016).
  58. Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Water contamination reduces the tolerance of coral larvae to thermal stress. PLoS One. 6, 19703 (2011).
  59. Brown, E. J., Resnick, S. M., Rebstock, C., Luong, H. V., Lindstrom, J. UAF radiorespirometric protocol for assessing hydrocarbon mineralization potential in environmental samples. Biodegradation. 2, 121-127 (1991).
  60. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  61. Vergin, K. L., et al. Screening of a Fosmid Library of Marine Environmental Genomic DNA Fragments Reveals Four Clones Related to Members of the Order Planctomycetales. Applied and Environmental Microbiology. 64 (8), 3075-3078 (1998).
  62. Yakimov, M. M., Timmis, K. N., Golyshin, P. N. Obligate oil-degrading marine bacteria. Current Opinion in Biotechnology. 18, 257-266 (2007).
  63. Santos, H. F., Cury, J. C., Carmo, F. L., Rosado, A. S., Peixoto, R. S. 18S rDNA sequences from microeukaryotes reveal oil indicators in mangrove sediment. PLoS One. 5, 12437 (2010).
  64. Jurelevicius, D., Cotta, S. R., Peixoto, R., Rosado, A. S., Seldin, L. Distribution of alkane-degrading bacterial communities in soils from King George Island, Maritime Antarctic. European Journal of Soil Biology. 51, 37-44 (2012).
  65. Paço, A., et al. Biodegradation of polyethylene microplastics by the marine fungus Zalerion maritimum. Science of the Total Environment. 586, 10-15 (2017).
  66. Zhang, W., Yin, K., Chen, L. Bacteria-mediated bisphenol A degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97, 5681-5689 (2013).
  67. Gadd, G. M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiology. 156, 609-643 (2010).
  68. Balcázar, J. L., et al. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology. 114, 173-186 (2006).
  69. Gatesoupe, F. J. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture. 180, 147-165 (1999).
  70. Ren, Y. X., Nakano, K., Nomura, M., Chiba, N., Nishimura, O. Effects of bacterial activity on estrogen removal in nitrifying activated sludge. Water Research. 41, 3089-3096 (2007).
  71. Santos-Gandelman, J. F., Giambiagi-deMarval, M., Muricy, G., Barkay, T., Laport, M. S. Mercury and methylmercury detoxification potential by sponge-associated bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 106, 585-590 (2014).
  72. Yamaga, F., Washio, K., Morikawa, M. Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 isolated from the rhizosphere of duckweed Lemna aoukikusa. Environmental Science & Technology. 44, 6470-6474 (2010).
  73. Soriano, A. U., et al. Microbiological aspects of biodiesel and biodiesel/diesel blends biodeterioration. International Biodeterioration & Biodegradation. 99, 102-114 (2015).
  74. Da Cunha, C. D., Rosado, A. S., Sebastián, G. V., Seldin, L., Von der Weid, I. Oil biodegradation by Bacillus strains isolated from the rock of an oil reservoir located in a deep-water production basin in Brazil. Applied Microbiology and Biotechnology. 73, 949-959 (2006).
  75. Prantera, M. T., Drozdowicz, A., Leite, S. G., Rosado, A. S. Degradation of gasoline aromatic hydrocarbons by two N 2-fixing soil bacteria. Biotechnology Letters. 24, 85-89 (2002).
  76. Lai, K. M., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Biotransformation and bioconcentration of steroid estrogens by Chlorella vulgaris. Applied and Environmental Microbiology. 68, 859-864 (2002).
  77. United Nations. . Transforming our World: The 2030 Agenda for Sustainable Development. , (2015).
  78. Bellwood, D. R., Hughes, T. P., Folke, C., Nyström, M. Confronting the coral reef crisis. Nature. 429, 827 (2004).
  79. Pandolfi, J. M., et al. Global trajectories of the long-term decline of coral reef ecosystems. Science. 301, 955-958 (2003).
  80. Bolland, E. G., Cook, A. R., Turner, N. A. Urea as a sole source of nitrogen for plant growth. I. The development of urease activity in Spirodela oligorrhiza. Planta. 83, 1-12 (1968).
  81. Kirkwood, M., Todd, J. D., Rypien, K. L., Johnston, A. W. B. The opportunistic coral pathogen Aspergillus sydowii contains dddP and makes dimethyl sulfide from dimethylsulfoniopropionate. The ISME Journal. 4, 147-150 (2010).
  82. Raina, J., Tapiolas, D., Motti, C., Foret, S., Seemann, T. Isolation of an antimicrobial compound produced by bacteria associated with reef-building corals. Peer J. 4, 2275 (2016).
  83. Ritchie, K. B. Regulation of microbial populations by coral surface mucus and mucus-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 322, 1-14 (2006).
  84. Gochfeld, D. J., Aeby, G. S. Antibacterial chemical defenses in Hawaiian corals provide possible protection from disease. Marine Ecology Progress Series. 362, 119-128 (2008).
  85. Alagely, A., Krediet, C. J., Ritchie, K. B., Teplitski, M. Signaling mediated cross-talk modulates swarming and biofilm formation in a coral pathogen Serratia marcescens. The ISME Journal. 5, 1609-1620 (2011).
  86. Kvennefors, E. C. E., et al. Regulation of bacterial communities through antimicrobial activity by the coral holobiont. Microbial Ecology. 63, 605-618 (2012).
  87. Biscere, T., et al. Enhancement of coral calcification via the interplay of nickel and urease. Aquatic Toxicology. 200, 247-256 (2018).
  88. Grover, R., Maguer, J., Allemand, D., Ferrier-Pages, C. Urea uptake by the scleractinian coral Stylophora pistillata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 332, 216-225 (2006).
  89. Crossland, C. J., Barnes, D. J. The Role of Metabolic Nitrogen in Coral Calcification. Marine Biology. 28, 325-332 (1974).
  90. Olson, N. D., Ainsworth, T. D., Gates, R. D., Takabayashi, M. Diazotrophic bacteria associated with Hawaiian Montipora corals: diversity and abundance in correlation with symbiotic dinoflagellates. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 371, 140-146 (2009).
  91. Lema, K. A., Willis, B. L., Bourneb, D. G. Corals form characteristic associations with symbiotic nitrogen-fixing bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 78, 3136-3144 (2012).
  92. Santos, H. F., et al. Climate change affects key nitrogen-fixing bacterial populations on coral reefs. The ISME Journal. 8, 2272-2279 (2014).
  93. Cardini, U., et al. Functional significance of dinitrogen fixation in sustaining coral productivity under oligotrophic conditions. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282, 20152257 (2015).
  94. Yang, S., Sun, W., Zhang, F., Li, Z. Phylogenetically diverse denitrifying and ammonia-oxidizing bacteria in corals Alcyonium gracillimum Tubastraea coccinea. Marine Biotechnology. 15, 540-551 (2013).
  95. de Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. M., Polonia, A. R. M., Gomes, N. C. M. Bacterial community composition and predicted functional ecology of sponges, sediment and seawater from the thousand islands reef complex, West Java, Indonesia. FEMS Microbiology Ecology. 91, (2015).
  96. Suggett, D. J., et al. Photosynthesis and production of hydrogen peroxide by Symbiodinium (Pyrrhophyta) phylotypes with different thermal tolerances. Journal of Phycology. 44, 948-956 (2008).
  97. Petasne, R. G., Zika, R. G. Hydrogen peroxide lifetimes in south Florida coastal and offshore waters. Marine Chemistry. 56, 215-225 (1997).
  98. McFall-Ngai, M. J. Consequences of evolving with bacterial symbionts: insights from the squid-Vibrio associations. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 30, 235-256 (1999).

Tags

BioremediationProbioticsMetaorganismCoral HealthPollution MitigationMicrobial StrainsIsolationScreeningBeneficial MicroorganismsContaminant DegradationConsortiumAntagonistic ActivityCoral PreservationSamplingCoral FragmentsMicrobiologySaline SolutionMacerationCulture Flask

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., Assis, J. M., Varona, N., Burke, C., Coil, D. A., Eisen, J. A., Peixoto, R. S. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60238, doi:10.3791/60238 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image