Анализ на кроветчебно-мозговой барьер целостности в Drosophila меланогастер
Summary
Кроветно-мозговой барьер целостности имеет решающее значение для работы нервной системы. В Drosophila melanogaster, гематоэнцефалический барьер образуется глиальными клетками во время позднего эмбриогенеза. Этот протокол описывает методы анализа для формирования гематоэнцефалический барьер формирования и поддержания в D. melanogaster эмбрионов и третьих личинок instar.
Abstract
Правильное развитие нервной системы включает в себя образование гематоэнцефалического барьера, диффузионного барьера, который жестко регулирует доступ к нервной системе и защищает нервную ткань от токсинов и патогенов. Дефекты в формировании этого барьера были связаны с невропатиями, и разрушение этого барьера наблюдалось во многих нейродегенеративных заболеваний. Поэтому крайне важно определить гены, которые регулируют формирование и поддержание гематоэнцефалического барьера для выявления потенциальных терапевтических целей. Для того, чтобы понять точную роль этих генов в нервном развитии, необходимо проанализировать влияние измененной экспрессии генов на целостность гематоэнцефалического барьера. Многие из молекул, которые функционируют в создании гематоэнцефалический барьер были найдены, чтобы быть сохранены через эукариотических видов, в том числе плодовая муха, Drosophila melanogaster. Фруктовые мухи оказались отличной модельной системой для изучения молекулярных механизмов, регулирующих развитие и функционирование нервной системы. Этот протокол описывает пошаговую процедуру анализа целостности гематоэнцефалического барьера во время эмбриональных и личинок стадии развития D. melanogaster.
Introduction
Во время развития, клеточная связь и взаимодействия имеют решающее значение для создания структуры и функции тканей и органов. В некоторых случаях эти клеточные взаимодействия блокировать органы из окружающей среды для обеспечения надлежащей функции органа. Это относится к нервной системе, которая изолирована гематоэнцефалический барьер (BBB). Дисфункция BBB у людей была связана с неврологическими расстройствами, включая эпилепсию, и разрушение барьера наблюдается при нейродегенеративных заболеваниях, включая рассеянный склероз и боковой амиотрофический склероз1. У млекопитающих BBB образуется тесными соединениями между эндотелиальными клетками2,3. Другие животные, в том числе плодовая муха, Drosophila melanogaster, имеют BBB, состоящий из глиальных клеток. Эти глиальные клетки образуют выборочно проницаемый барьер для контроля движения питательных веществ, отходов, токсинов и крупных молекул в и из нервной системы4. Это позволяет для поддержания электрохимического градиента, необходимого для противопожарного действия потенциалов, что позволяет мобильность и координацию4. В D. melanogaster, глия защитить нервную систему от калия богатых, кровь, как гемолимфа5.
В центральной нервной системе (ЦНС) и периферической нервной системе (PNS) D. melanogaster, два внешних глиальных слоя, субпериневральная глия и периневиальная глия, а также внешняя сеть внеклеточной матрицы, нейронная ламелла, образуют гемолимф-мозг и гемолимф-нервбарьер6, называют BBB на протяжении всей этой статьи. Во время развития субпериневральная глия становится полиплоидной и увеличивается, чтобы окружить нервнуюсистему5,6,7,9,10,11 . Субпериневриальное глия образуют перекрестные соединения, которые обеспечивают основной диффузионный барьер между гемолимфой и нервной системой5,6,12. Эти соединения молекулярно похожи на перегородки, как соединения, найденные в паранодах миелинизирующей глии у позвоночных, и они выполняют ту же функцию, что и плотные соединения в BBB млекопитающих13,14, 15 лет , 16 Год , 17. Периневиальная глия разделить, расти, и обернуть вокруг subperineurial глии для регулирования диффузии метаболитов и больших молекул6,10,18,19. Формирование BBB завершается на 18,5 ч после откладки яиц (AEL) при 25 градусах по Цельсию5,8. Предыдущие исследования выявили гены, которые являются критическими регуляторами формирования BBB20,21,22. Чтобы лучше понять точную роль этих генов, важно изучить влияние мутации этих потенциальных регуляторов на целостность BBB. Хотя предыдущие исследования наметили подходы для наблюдения BBB целостности эмбрионов и личинок, всеобъемлющий протокол для этого исследования до сих пор не описано5,7. Этот пошаговой протокол описывает методы для оценки целостности BBB во время эмбриональных и третьих этапов личинок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол содержит подробное описание шагов, необходимых для оценки целостности BBB во время поздних эмбриональных и третьих этапов личинок D. melanogaster развития. Аналогичные подходы были описаны в другом месте, чтобы рассказать о целостности BBB во время развития, а также на взросл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-ра Ф. Брайана Пикетта и доктора Родни Дейла за использование оборудования для инъекций. Эта работа финансировалась за счет финансирования исследований от Университета Лойола Чикаго до M.D., D.T., и JJ.
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
References
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin–novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- . BDSC Cornmeal Food Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017)
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
