שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר
Summary
שלמות מכשול הדם במוח. היא קריטית לתפקוד מערכת העצבים בדרוזופילה מלאנוסטר, מכשול המוח בדם נוצר על ידי תאי גלאל במהלך הembryogenesis המאוחרות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיפול בתפקוד ותחזוקה של מחסומי מוח בדם בד. מלאנוגסטר עוברים והזחלים השלישי.
Abstract
התפתחות מערכת העצבים הנכונה כוללת את היווצרות מכשול הדם-מוח, מכשול הדיפוזיה המסדיר את הגישה למערכת העצבים ומגן על רקמת העצבים מפני רעלים ופתוגנים. פגמים בהיווצרות מכשול זה היו מתואמים neuropathies, ואת התמוטטות של מכשול זה נצפתה במחלות ניווניות רבות. לכן, חיוני לזהות את הגנים המסדירים את היווצרות והאחזקה של מחסום הדם-מוח כדי לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות. כדי להבין את התפקידים המדויקים גנים אלה לשחק בהתפתחות העצבית, יש צורך לעבד את ההשפעות של ביטוי גנים שונה על השלמות של מכשול המוח בדם. רבים מהמולקולות הפועלות בהקמת המכשול ממוח הדם נמצאו להיות שמרו על פני מינים איקריוטית, כולל זבוב הפירות, drosophila ילה מלאנוגסטר. זבובי פירות הוכחו כמערכת מודל מצוינת לבדיקת המנגנונים המולקולריים המסדירים פיתוח ותפקוד של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר הליך צעד-אחר-צעד לצורך שלמות מכשול המוח בדם במהלך השלבים העובריים והזחל של ד. מלאנוגסטר פיתוח.
Introduction
במהלך הפיתוח, תקשורת תא תא ואינטראקציות הן קריטיות להקמת מבנה רקמות ואיברים ותפקוד. במקרים מסוימים, אינטראקציות תא תא אלה ממקכבות איברים מהסביבה הסובבת כדי להבטיח את תפקוד האיברים התקין. זהו המקרה של מערכת העצבים, אשר מבודדת על ידי מכשול הדם-מוח (BBB). תפקוד של BBB בבני אדם נקשר הפרעות נוירולוגיות כולל אפילפסיה, ואת התמוטטות של המכשול נצפתה מחלות נוירוניווניות כולל טרשת נפוצה amyotrophic לרוחב1. ב יונקים, bbb נוצר על ידי הצמתים הדוקים בין תאים אנדותל2,3. בעלי חיים אחרים, כולל זבוב הפירות, דרוזופילה מלאנוסטר, יש bbb מורכב מתאי גלאל. אלה תאים גליה טופס מכשול חדיר סלקטיבי לשלוט בתנועה של חומרים מזינים, פסולת מוצרים, רעלים, ומולקולות גדולות לתוך ומתוך מערכת העצבים4. הדבר מאפשר שמירה על מעבר אלקטרוכימי הנחוץ לירי בפוטנציאל הפעולה המאפשר ניידות ותיאום4. ב D. melanogaster, the glia להגן על מערכת העצבים מן האשלגן עשיר, כמו דם המוליקמ5.
במערכת העצבים המרכזית (cn) ומערכת העצבים ההיקפית (היקפית) של D. melanogaster, שתי שכבות גליה החיצוני, את subperineurial glia ואת perineurial glia, כמו גם רשת חיצונית של מטריצה החילוץ, הנוירולה העצבי, הטופס המוליקמ-המוח המוליש-מחסום העצב6, המכונה bbb לאורך מאמר זה. במהלך פיתוח subperineurial glia להיות פוליפואיד ולהגדיל כדי להקיף את מערכת העצבים5,6,7,8,9,10,11 . הצמתים subperineurial glia טופס septate, אשר מספקים את מכשול הדיפוזיה העיקרי בין המוליקמ ומערכת העצבים5,6,12. הצמתים הללו דומים מאוד לצמתים בעלי החוליות הדומות, שנמצאו בפרפודות של המייאלוציה של גליה, והוא מבצע את אותו התפקיד כצמתים הדוקים ב-bbb של יונקים13,14, מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , 17. perineurial glia הפער, לגדול, ולעטוף סביב subperineurial glia כדי לווסת את הדיפוזיה של מטבוליטים ומולקולות גדולות6,10,18,19. היווצרות bbb הושלם על ידי 18.5 h לאחר הנחת ביצה (ח) ב -25 ° c5,8. מחקרים קודמים זיהו גנים כי הם הרגולטורים קריטיים של היווצרות bbb20,21,22. כדי להבין טוב יותר את התפקידים המדויקים של גנים אלה, חשוב לבחון את ההשפעה של מוטציה של הרגולטורים הפוטנציאליים האלה על שלמות BBB. בעוד שמחקרים קודמים מתארים גישות למתן שלמות bbb בעוברים ובזחלים, פרוטוקול מקיף לצורך שיטת מחקר זו טרם תואר5,7. פרוטוקול זה, שלב אחר שלב, מתאר שיטות לגבי שלמות BBB במהלך שלבי הזחל העובריים והשלישי של מלאנוגסטר .
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק תיאור מקיף של השלבים הדרושים לטיפול בשלמות BBB במהלך שלבי הזחל המאוחרים והשלישי של התפתחות D. מלאנוגסטר . גישות דומות תוארו במקום אחר כדי לקיים את שלמות bbb במהלך הפיתוח, כמו גם למבוגרים בשלבים5,7,29,30. ע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד ר פ. בריאן פיקט וד ר רודני דייל לשימוש בציוד להזרקה. עבודה זו ממומנת על ידי מימון מחקר מאוניברסיטת לויולה שיקגו ל-md, D.T., ו-ג’יג’י
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
References
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin–novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- . BDSC Cornmeal Food Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017)
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
