Assay für Blut - Hirn-Barriere Integrität in Drosophila melanogaster
Summary
Blut – Hirn-Schranke Integrität ist entscheidend für die Funktion des Nervensystems. Bei Drosophila melanogasterwird die Blut-Hirn-Schranke bei der späten Embryogenese durch Gliazellen gebildet. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Bildung und Erhaltung von Blut-Hirn-Barrieren bei D. melanogaster Embryonen und dritten Instarlarven.
Abstract
Die richtige Entwicklung des Nervensystems umfasst die Bildung der Blut- und Hirnschranke, der Diffusionsbarriere, die den Zugang zum Nervensystem streng reguliert und das Nervengewebe vor Giftstoffen und Krankheitserregern schützt. Defekte bei der Bildung dieser Barriere wurden mit Neuropathien korreliert, und der Abbau dieser Barriere wurde bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet. Daher ist es wichtig, die Gene zu identifizieren, die die Bildung und Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke regulieren, um potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Um die genaue Rolle dieser Gene bei der neuronalen Entwicklung zu verstehen, ist es notwendig, die Auswirkungen der veränderten Genexpression auf die Integrität der Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen. Viele der Moleküle, die bei der Etablierung der Blut – Hirn-Schranke funktionieren, wurden gefunden, um über eukaryotische Arten konserviert werden, einschließlich der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster. Fruchtfliegen haben sich als ausgezeichnetes Modellsystem zur Untersuchung der molekularen Mechanismen zur Regulierung der Entwicklung und Funktion des Nervensystems erwiesen. Dieses Protokoll beschreibt ein Schrittweiseverfahren zur Untersuchung der Integrität der Blut- und Hirnschranke während der embryonalen und larven endenden Stadien der D. melanogaster Entwicklung.
Introduction
Während der Entwicklung sind Zell-Zell-Kommunikation und Wechselwirkungen entscheidend für die Etablierung von Gewebe- und Organstruktur und -funktion. In einigen Fällen versiegeln diese Zell-Zell-Wechselwirkungen Organe aus der Umgebung, um eine ordnungsgemäße Organfunktion zu gewährleisten. Dies gilt für das Nervensystem, das durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) isoliert wird. Dysfunktion der BBB beim Menschen wurde mit neurologischen Erkrankungen einschließlich Epilepsie verbunden, und Abbau der Barriere wurde bei neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Multipler Sklerose und amyotrophe Lateralsklerose beobachtet1. Bei Säugetieren wird das BBB durch enge Kreuzungen zwischen den Endothelzellen2,3gebildet. Andere Tiere, einschließlich der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, haben ein BBB, das aus Gliazellen besteht. Diese Gliazellen bilden eine selektiv durchlässige Barriere, um die Bewegung von Nährstoffen, Abfallprodukten, Toxinen und großen Molekülen in und aus dem Nervensystem zu kontrollieren4. Dies ermöglicht die Aufrechterhaltung des elektrochemischen Gradienten, der notwendig ist, um Einwirkungspotentiale abzufeuern, was Mobilität und Koordination ermöglicht4. In D. melanogasterschützen die Glia das Nervensystem vor der kaliumreichen, blutähnlichen Hämolymphe5.
Im Zentralnervensystem (ZNS) und peripheren Nervensystem (PNS) von D. melanogasterbilden zwei äußere Gliaschichten, die subperineuriale Glia und die perineuriale Glia, sowie ein äußeres Netzwerk extrazellulärer Matrix, die neuronale Lamelle, die Hämolymphe-Gehirn und Hämlymph-Nerven-Barriere6, in diesem Artikel als BBB bezeichnet. Während der Entwicklung subperineurialglia werden polyploid und vergrößern, um das Nervensystem zu umgeben5,6,7,8,9,10,11 . Die subperineurialen Glia bilden Septat-Kreuzungen, die die Hauptdiffusionsbarriere zwischen der Hämolymphe und dem Nervensystem5,6,12. Diese Kreuzungen ähneln molekular den septatartigen Kreuzungen, die an den Paranoden der myelinierenden Glia in Wirbeltieren gefunden werden, und sie erfüllen die gleiche Funktion wie enge Kreuzungen in der BBB von Säugetieren13,14, 15 , 16 , 17. Die perineuriale Glia teilen, wachsen und wickeln um die subperineuriale Glia, um die Diffusion von Metaboliten und großen Molekülenzuregulieren 6,10,18,19. Die BBB-Formation ist nach der Eiablage (AEL) bei 25 °C5,8um 18,5 h abgeschlossen. Frühere Studien haben Gene identifiziert, die kritische Regulatoren der BBB-Bildung20,21,22sind. Um die genauen Rollen dieser Gene besser zu verstehen, ist es wichtig, die Auswirkungen der Mutation dieser potenziellen Regulatoren auf die BBB-Integrität zu untersuchen. Während frühere Studien Ansätze für die Prüfung der BBB-Integrität in Embryonen und Larven skizziert haben, muss ein umfassendes Protokoll für diesen Test noch beschrieben werden5,7. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll beschreibt Methoden zur Prüfung der BBB-Integrität während der D. melanogaster embryonalen und dritten instar larval Enden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll enthält eine umfassende Beschreibung der Schritte, die erforderlich sind, um die BBB-Integrität während der späten embryonalen und dritten instar larvalen Stadien der D. melanogaster Entwicklung zu assay. Ähnliche Ansätze wurden an anderer Stelle beschrieben, um die Integrität des BBB während der Entwicklung sowie in erwachsenen Stadien5,7,29,30zu bewerten. Die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. F. Bryan Pickett und Dr. Rodney Dale für die Verwendung von Injektionsgeräten. Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder von der Loyola University Chicago an M.D., D.T. und J.J. finanziert.
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
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